Live cell imaging of meiosis in anthers of Arabidopsis thaliana

Abstract

Meiosis is a crucial event for sexual reproduction; during its course the chromosome number is halved, and recombination between homologs takes place. Understanding how meiosis is regulated in plants has a direct impact on breeding applications and, therefore, researchers invest constant effort in studying its fundamental aspects. Extensive knowledge about the meiotic progression results from the cytological analysis of fixed material. Although highly informative, this approach is not sufficient to understand the dynamics of meiosis; numerous works have demonstrated that key meiotic events as homologs paring and segregation are heavily dependent on chromosome movements and cytoskeleton rearrangements, underpinning the need of a spatiotemporal description of the cell division. This dissertation introduces a live cell imaging technique, based on confocal microscopy, which allows the observation of the entire meiotic division of pollen mother cells of Arabidopsis thaliana. In this study, the behavior of single meiocytes is monitored throughout the progression of meiosis by the simultaneous visualization of the meiotic subunit of cohesin, RECOMBINATION 8 (REC8), and microtubules. The double reporter line, named KINGBIRD (Kleisin IN Green, tuBulin In ReD), allows the description of five cellular features: cell shape, nucleus position, nucleolus position, chromosome conformation, and microtubule array. These features combine in a non-random manner to form cellular states; the analysis here performed led to the identification of 11 principal states, referred to as landmarks, which are convergent points of the meiotic progression. Using the landmark system as a reference, it was possible to describe a precise time course of meiosis, which included the duration of short and asynchronous phases, such as metaphases and anaphases. Taken together, the here established microscopy technique and landmark system constitute a novel approach, which opens new ways to the study of plant meiosis.

Die Meiose ist ein essentieller Schritt der sexuellen Fortpflanzung; während ihres Verlaufs wird die Chromosomenzahl halbiert und eine Rekombination zwischen homologen Chromosomen ermöglicht. Unser Verständnis der Regulation der Meiose in Pflanzen ist für die Pflanzenzüchtung von direktem Interesse, weshalb große Anstrengungen unternommen werden, die grundlegenden Abläufe zu verstehen. Aus der zytologischen Analyse von fixiertem Material wurde bereits umfangreiches Wissen über den grundsätzlichen Ablauf der Meiose gewonnen. Obwohl sehr informativ, reicht dieser Ansatz aber nicht aus, um die Dynamik der Meiose im Detail zu verstehen. Zahlreiche Arbeiten haben gezeigt, dass meiotische Schlüsselereignisse wie Paarung der Homologen und deren Segregation stark von Chromosomenbewegungen und Zytoskelettumlagerungen abhängen, was die Notwendigkeit einer genauen räumlich-zeitlichen Beschreibung der meiotischen Zellteilung untermauert. Mit dieser Dissertation wird eine Technik zur Lebendzellbeobachtung während der Meiose eingeführt, die auf konfokaler Lasermikroskopie basiert und die Beobachtung des gesamten Ablaufs der meiotischen Teilung der Pollenmutterzellen von Arabidopsis thaliana ermöglicht Durch eine gleichzeitige Visualisierung der Mikrotubuli und der meiotischen Untereinheit von Kohäsin, RECOMBINATION 8 (REC8), kann die Entwicklung einzelner Meiozyten während des Verlaufs der Meiose genau mitverfolgt werden. Die hierfür konstruierte zweifache Reporterlinie namens KINGBIRD (Kleisin IN Green, tuBulin In ReD) ermöglicht die Beschreibung von fünf Zellmerkmalen: Zellform, Position des Zellkerns, Position des Nucleolus im Zellkern, Chromosomenkonformation und die Anordnung der Mikrotubuli. Die spezifische Kombination dieser Merkmale charakterisiert jeweils bestimmte meiotische Stadien. Die hier durchgeführte Analyse führte zur Identifizierung von 11 Hauptzuständen, sogenannten Referenzpunkten, die konvergente Punkte des meiotischen Ablaufs darstellen. Mit Hilfe des Referenzpunkt-Systems konnte ein genauer zeitlicher Verlauf der Meiose beschrieben werden, der es nun ermöglicht, auch die Dauer kurzer und asynchroner Phasen, wie Metaphase und Anaphase, präzise zu erfassen. Die hier etablierte mikroskopische Technik zur Lebendbeobachtung und das Referenzpunkt-System stellen einen innovativen Ansatz dar, der es ermöglicht, neue Wege in der Erforschung der Meiose in Pflanzen zu gehen.