Trennung und Analyse von Glycoproteinstrukturen mittels online und offline Lektinaffinitätschromatographie-MS und NMR-Spektroskopie

Abstract

Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis IV 1 Einleitung 1 1.1 Das Glycom 1 1.1.1 Biosynthese der Glycane 2 1.1.2 Vielfalt und Funktionsweise der Glycane 4 1.2 Lektine 6 1.2.1 Klassifizierung der Lektine 8 1.2.2 Interaktionen der Lektine in physiologischen Erkennungsprozessen 9 1.2.3 Multivalenz 10 1.2.4 N-Acetylneuraminsäure-bindende Lektine 11 2 Methoden 12 2.1 Methoden zur Trennung komplexer Glycangemische 12 2.1.1 Affinitätschromatographie 13 2.2 Analytik mittels gekoppelter Techniken 14 2.2.1 Entwicklung und Einsatzbereiche gekoppelter Techniken 14 2.2.2 LC-NMR-Spektroskopie 15 2.2.3 Massenspektrometrie in Glycoproteomics und Glycomics 21 3 Computer und Programmierung 24 3.1 Die Programmiersprache BASIC 24 3.2 Die Programmiersprache C++ 25 3.3 Die Programmiersprache Matlab 25 3.4 Entstehung der seriellen Datenübertragung 26 3.4.1 Modems und RS232 27 4 Aufgabenstellung 29 5 Ergebnisse und Diskussion 30 5.1 Konzeption und Realisierung eines LC-NMR-Systems 30 5.1.1 Pumpensystem, Injektionsventil und Fraktionssammler 30 5.1.2 Magnetventil und Relaisbox 31 5.1.3 Affinitätssäulen 32 5.1.4 NMR-Spektrometer und LC-Flusskopf 32 5.1.5 Der Aufbau des LC-NMR-Systems 32 5.2 Entwicklung einer Software zur Steuerung des LC-Systems 34 5.2.1 Programmierung des PRC-Programms 34 5.2.2 Softwareentwicklung mit Hilfe von Visual Basic .NET 37 5.2.3 Integration des Fraktionssammlers in das LC-System 44 5.3 Programmierung in TopSpin 45 5.3.1 Aufnahme von NMR-Spektren zur Evaluation des LC-Systems 45 5.3.2 Programmierung eines AU-Programms 46 5.4 Experimente zur Validierung des LC-Systems 47 5.4.1 Druckaufbau im LC-System 47 5.4.2 online Lektinaffinitätschromatographie-NMR-Experimente 50 5.5 Modellglycoprotein Fetuin 59 5.5.1 offline 1H-NMR-Experimente der Fetuinglycane 62 5.5.2 offline ESI-TOF-MS der Fetuinglycane 66 5.5.3 PGC-LC-MS der Fetuinglycane 69 5.6 online stop-flow Lektinaffinitätschromatographie-NMR-Experimente 72 5.7 offline Lektinaffinitätschromatographie-Experimente 77 5.7.1 offline Lektinaffinitätschromatographie-MS mit N Acetylneuraminsäure 78 5.7.2 offline Lektinaffinitätschromatographie-MS mit Fetuinglycanen 81 5.7.3 offline Lektinaffinitätschromatographie-NMR-Spektroskopie 91 5.8 Korrelation mit der Methode der kleinsten Fehlerquadrate 92 5.8.1 Konstruktion eines Models zur Berechnung von lsqnonneg-Fits 93 5.8.2 Auswertung der lsqnonneg-Korrelationskoeffizienten 97 5.9 Ausblick 107 6 Zusammenfassung 108 7 Summary 111 8 Experimenteller Teil 114 8.1 Programmieren in Matlab 114 8.1.1 Import von NMR-Daten 114 8.1.2 moving window-Funktion 114 8.1.3 Generierung von SUGABASE-Daten 116 8.1.4 Erstellung artifizieller N-Glycane 116 8.1.5 Erstellung der peak picking-Daten für automatisierte Beschriftungen 125 8.1.6 Vergleich eigener Spektren mit simulierten SUGABASE-Spektren 125 8.1.7 automatisierter Export von Bildern mit FIG_2_EPS 126 8.1.8 Basislinienkorrektur 126 8.1.9 Import und Auswertung der offline-MS-Daten (Masshunter) 127 8.1.10 Import und Auswertung der offline-MS-Daten (DataAnalysis) 128 8.1.11 Ausgleichungsrechnung mit der Methode der kleinsten Fehlerquadrate 132 8.2 Origin 135 8.2.1 Kurvenanpassung der N Acetyl D glucosamin-Verdünnungsreihe 135 8.3 Allgemeine Arbeitsvorschriften 136 8.3.1 Entgasen von Wasser 136 8.3.2 tryptischer Verdau des Fetuins 136 8.3.3 Abspaltung der Fetuinglycane mittels PNGase F 137 8.3.4 RP-SPE-Chromatographie 137 8.3.5 Anreichern von Glycanen mit Carbon Micropipette Tips 138 8.3.6 Reinigung von well plates 138 8.3.7 Überführung von Proben zwischen well plates und NMR-Röhrchen 138 8.3.8 Entsalzen von Proben 139 8.4 Gerätespezifische Vorschriften 140 8.4.1 Einbau des LC-NMR-Flusskopfes 140 8.4.2 Ausbau des LC-NMR-Flusskopfes 140 8.4.3 Aufnahme und Prozessierung von NMR-Spektren 141 8.4.4 offline ESI-TOF-MS der Fetuinglycane 146 8.4.5 PGC-LC-MS der Fetuinglycane 146 8.4.6 offline Lektinaffinitätschromatographie 147 8.4.7 offline Lektinaffinitätschromatographie-Massenspektrometrie 149 8.5 Verwendete Materialien 151 8.6 Verwendete Chemikalien 152 8.7 Pufferlösungen 152 8.8 Verwendete Geräte 153 8.9 Verwendete Software 154 8.10 Modifizierte AU- und Pulsprogramme 155 8.10.1 prc_ts_lcnmr.vFINAL.cpp 155 8.10.2 zgesgp2D_3.ab 164 8.10.3 zgesgp2D_4.ab 166 9 Toxikologische Daten 168 10 Literaturverzeichnis 169 11 Danksagung 183 12 CURRICULUM VITAE 185 13 Erklärung 186

Contents List of abbreviations IV 1 introduction 1 1.1 The Glycom 1 1.1.1 biosynthesis of glycans 2 1.1.2 Diversity and functioning of the glycans 4 1.2 lectins 6 1.2.1 classification of lectins 8th 1.2.2 interactions of Lectins in physiological recognition processes 9 1.2.3 multivalence 10 1.2.4 N-Acetylneuraminic acid binding lectins 11 2 methods 12 2.1 Methods for the separation of complex Glycan mixtures 12 2.1.1 affinity 13 2.2 Analysis by coupled techniques 14 2.2.1 Development and applications of coupled techniques 14 2.2.2 LC-NMR spectroscopy 15 2.2.3 Mass Spectrometry in Glycoproteomics and Glycomics 21 3 Computers and Programming 24 3.1 The BASIC programming language 24 3.2 The C ++ Programming Language 25 3.3 the programming language Matlab 25 3.4 origin of the serial data transmission 26 3.4.1 Modems and RS232 27 4 task 29 5 Results and discussion 30 5.1 Design and implementation of the LC-NMR system 30 5.1.1 Pump system, injection valve, and fraction collector 30 5.1.2 Solenoid valve and relay 31 5.1.3 affinity columns 32 5.1.4 NMR spectrometer and LC flow head 32 5.1.5 The structure of the LC-NMR system 32 5.2 Development of a software for the control of the LC system 34 5.2.1 Programming the PRC program 34 5.2.2 Software development using Visual Basic .NET 37 5.2.3 Integration of the fraction collector in the LC system 44 5.3 programming in TopSpin 45 5.3.1 Recording NMR spectra for the evaluation of the LC system 45 5.3.2 Programming an AU program 46 5.4 Experiments to validate the LC system 47 5.4.1 Pressure build-up in the LC system 47 5.4.2 on-line Lectin affinity chromatography NMR experiments 50 5.5 Model glycoprotein fetuin 59 5.5.1 offline 1H NMR experiments with fetuinglycans 62 5.5.2 offline ESI-TOF-MS with fetuinglycans 66 5.5.3 PGC-LC-MS of fetuinglycans 69 5.6 on-line stop-flow lectin affinity NMR experiments 72 5.7 offline Lectin affinity chromatography experiments 77 5.7.1 offline Lectin affinity chromatography-MS with N-acetylneuraminic 78 5.7.2 offline Lectin affinity chromatography-MS Fetuinglycanens 81 5.7.3 offline Lectin affinity NMR spectroscopy 91 5.8 Correlation with the method of least squares 92 5.8.1 Construction of a model for the calculation of lsqnonneg-Fits 93 5.8.2 evaluation of lsqnonneg correlation coefficient 97 5.9 outlook 107 6 Summary 108 7 Summary 111 8 experimental section 114 8.1 programming in Matlab 114 8.1.1 Import of NMR data 114 8.1.2 moving window function 114 8.1.3 Generating data from SUGABASE 116 8.1.4 Creating artificial N-glycans 116 8.1.5 Creation of peak picking data for automated captions 125 8.1.6 Comparing own spectra with simulated spectra from SUGABASE 125 8.1.7 automated export of images with FIG_2_EPS 126 8.1.8 Baseline correction 126 8.1.9 Import and evaluation of offline-MS data (MassHunter) 127 8.1.10 Import and evaluation of offline-MS data (Data Analysis) 128 8.1.11 Adjustment computation using the method of least squares 132 8.2 Origin 135 8.2.1 Curve Fitting of N-Acetyl-D-glucosamine dilution series 135 8.3 General working instructions 136 8.3.1 Degassing of water 136 8.3.2 Tryptic digestion of fetuin 136 8.3.3 elimination of the fetuinglycans by PNGase F digestion 137 8.3.4 RP-SPE chromatography 137 8.3.5 enriching glycans with Carbon Micro Pipette Tips 138 8.3.6 cleaning well plates 138 8.3.7 Transferring samples between well plates and NMR tubes 138 8.3.8 Desalting of samples 139 8.4 Device-specific regulations 140 8.4.1 Installation of LC-NMR-flow head 140 8.4.2 Removal of LC-NMR-flow head 140 8.4.3 recording and Processing of NMR spectra 141 8.4.4 offline ESI-TOF-MS with Fetuinglycans 146 8.4.5 PGC-LC-MS of with Fetuinglycans 146 8.4.6 offline lectin affinity chromatography 147 8.4.7 offline Lectin affinity chromatography mass spectrometry 149 8.5 materials used 151 8.6 chemicals used 152 8.7 buffer solutions 152 8.8 equipment used 153 8.9 Used software 154 8.10 Modified AU and pulse programs 155 8.10.1 prc_ts_lcnmr.vFINAL.cpp 155 8.10.2 zgesgp2D_3.ab 164 8.10.3 zgesgp2D_4.ab 166 9 Toxicological data 168 10 bibliography 169 11 note of thanks 183 12 CURRICULUM VITAE 185 13 statement 186