Analyse der Temozolomid-Sensitivität von humanen Glioblastomzellen in Abhängigkeit von Mismatch-Reparatur und Replikationsstress

Abstract

Das Glioblastom (GBM) ist der häufigste maligne Hirntumor im Erwachsenenalter und geht mit einer infausten Prognose einher. Die Lebenserwartung liegt nach Diagnosestellung unter leitliniengerechter Standardtherapie bei ca. 14 Monaten. Ein besseres Therapieansprechen und verlängertes Gesamtüberleben ist bei Patienten mit O6-mehtylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT)-Promoter methylierten Tumoren zu erwarten. Da nur wenige biologische Marker für das GBM bekannt sind, welche mit einem verbesserten Therapieansprechen und einem erhöhten Gesamtüberleben (OAS) assoziiert werden, gilt es weitere Marker zu identifizieren. Es ist bekannt, dass die Wirkung von Temozolomid (TMZ) durch eine funktionelle Mismatch-Reparatur (MMR) vermittelt wird. Hierbei entstehen nach vergeblicher Fehlpaarung von Thymin gegenüber der methylierten Base O6-mehtyl-Guanin (O6-meG) in Abhängigkeit des darauffolgenden Replikationszyklus letale Doppelstrangbrüche (DSBs). Es ist jedoch noch nicht abschließend geklärt, welchen prädiktiven Wert die MMR-Proteinexpression in einem heterogenen Zellmodell im Ansprechen auf TMZ hat. Darüber hinaus zeigte sich in Vorarbeiten von Struve, dass in isogenetischen MGMT-negativen GBM-Zellen, die eine konstitutive Variante des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFRvIII) exprimieren, eine gesteigerte Sensitivität gegenüber TMZ im Vergleich zu EGFRvIII-negativen Zellen bestand. In den TMZ-sensitiven EGFRvIII-positiven Zellen konnte darüber hinaus ein erhöhter Replikationsstress detektiert werden. Vor diesem Hintergrund sollte in der vorliegenden Arbeit der Zusammenhang zwischen der MMR-Proteinexpression sowie der Expression der DNA-damage response (DDR)- und der Replikationsstressproteine in Bezug auf die TMZ-Sensitivität in einem heterogenen Zellmodell von zehn MGMT-negativen GBM-Zelllinien untersucht werden. Darüber hinaus sollte ermittelt werden, ob diese Faktoren als prädiktive Biomarker für das Ansprechen von TMZ etabliert werden können. Trotz ausgeprägter inhibitorischer Effekte von TMZ auf die Proliferation, zeigte sich in den MGMT-negativen GBM-Zelllinien ein sehr heterogenes Ansprechen im klonogenen Zellüberleben nach TMZ-Behandlung. Die Proteinexpression der MMR-Proteine (MSH2, MSH6, MLH1 und PMS2) variierte stark in den untersuchten GBM-Zelllinien. Ein Knockdown des MMR-Protein MSH6 führte in der TMZ-sensitiven GBM-Zelllinie LN229 zur Resistenzsteigerung gegenüber TMZ, jedoch konnte keine statistisch relevante Korrelation zwischen der MMR-Proteinexpression und dem zellulären Überleben in dem betrachteten heterogenen Zellmodell nach Behandlung mit TMZ festgestellt werden. Eine signifikante Korrelation der Expression wurde jedoch für die Dimerisierungspartner von MutS (MSH2 und MSH6) und MutL (MLH1 und PMS2) zueinander ermittelt. Die Detektion des Replikationsstresses in den GBM-Zellen erfolgte mittels Western Blot. Alle untersuchten Proteine standen in Zusammenhang mit Replikationsstress oder der resultierenden DDR. Es zeigte sich ebenfalls eine heterogene Expression der Replikationsstressproteine in dem betrachteten Zellmodell. Eine Korrelation mit der TMZ-Sensitivität bestand ausschließlich für den Aktivitätsindex von pATR/ATR. Es konnte in dieser Arbeit keine statistisch relevante Korrelation in dem betrachteten heterogenen Zellmodell von MGMT-negativen GBM-Zelllinien zwischen der MMR-Proteinexpression und der Expression von DDR- und Replikationsstressproteinen in Bezug auf das Ansprechen von TMZ hergestellt werden. Die untersuchten Einflussfaktoren eignen sich folglich in diesem Zellmodell nicht als prädiktive Marker für ein suffizienteres Ansprechen von MGMT-negativen GBM-Zellen auf TMZ.

Glioblastomas (GBM) are the most common malignant brain tumours in adults and are related to an unfavourable prognosis. In average, the survival after diagnosis under standard treatment is limited to approximately 14 months. A better prognosis is linked to the methylation of O6-mehtylguanine-DNA-Methyltransferase (MGMT)-gene in patients’ tumour. Currently there are only a limited number of biological markers available that predict response to therapy and are associated with a prolonged overall survival (OAS). Therefore, it is of high interest to identify additional marker in the nearest future. It is known that the mismatch repair (MMR) is a key factor in the mechanism of action of Temozolomide (TMZ), which generates double strand breaks (DSBs) in the upcoming round of replication after futile mispairing of thymine on the opposite side of the methylated base O6-methyl-Guanin (O6-meG). But until now it remains unclear which predictive value the expression of MMR-protein compromises in the response to TMZ in a heterogeneous cell model. Furthermore, previous work of Struve had shown that isogenetic MGMT-negative GBM cells, which express the epidermal growth factor receptor (EGFR) deletion mutant EGFRvIII, also display an increased sensitivity towards TMZ, compared to EGFRvIII-negative cells. Furthermore, the EGFRvIII-positive cells presented increased replication stress compared to their EGFRvIII- counterpart. In this context, the MMR-protein expression as well as the expression of replication stress protein and DNA-damage response (DDR) proteins were analysed in a heterogeneous cell model of ten MGMT-negative GBM cell lines towards their relation to TMZ-sensitivity. Furthermore, it was analysed if the expression of these proteins could predict TMZ response and serve therefore as biological markers for therapy response. Although strong inhibitory effects of TMZ on proliferation were noticed, all MGMT-negative cell lines however displayed a heterogeneous response towards TMZ-treatment. Additionally, the expression of the relevant MMR-proteins (MSH2, MSH6, MLH1 and PMS2) showed a strong variability within all analysed cell lines. Although a knockdown of the MMR-protein MSH6 in one of the TMZ-sensitive cell lines (LN229) led to an increase in TMZ-resistance, no correlation was observed between the MMR-protein expression and TMZ sensitivity. Nevertheless, a significant correlation was observed, considering the protein expression of the dimerization partners of MutL (MSH2 and MSH6) and MutL (MLH1 and PMS2). Replication stress was detected by western blot analysis. All investigated proteins were related to replication stress or the consecutive DDR. A diverse range of protein expression was observed throughout all cell lines. Except the activity index of pATR/ATR, no significant coherence could be found regarding TMZ-sensitivity. Altogether, this thesis was unable to provide any statistically relevant relation between MMR-protein expression or expression of DDR- and replication stress proteins regarding TMZ sensitivity in a heterogenic MGMT-negative cell model of ten human GBM cell lines. Therefore, the investigated factors cannot serve as predictive markers for TMZ response in this cell model.