Die Rolle von CD73 für die Funktion und Entwicklung von B-Lymphozyten

Abstract

In dieser Arbeit habe ich zunächst ein Färbeschema (Panel) für die durchflusszytometrische Differenzierung von B-Zell Subpopulationen für den Gebrauch in der immunologischen Diagnostik erstellt. Teil dieses Panels war der Marker CD73, dessen Expressionsmuster auf B-Zell-Populationen und dessen Funktion auf B-Zellen bisher noch unklar sind. Dieses Panel wurde anschließend genutzt, um die Expression von CD73 im Verlauf der peripheren B-Zell-Differenzierung zu untersuchen, und um anhand verschiedener Patientenkohorten den Wert von CD73 als diagnostischen Marker bei der Beurteilung der B-Zell-Reifung festzustellen. Die Analyse von CD73 auf B-Zellen von HIV Patienten zeigte, dass HIV Patienten weniger CD73 auf ihren B-Zellen exprimierten als gesunde Spender. Diese Patienten zeigten darüber hinaus ähnliche Veränderungen in der Zusammensetzung ihrer B-Zellen wie CVID Patienten. Dies drückte sich unter anderem in einer relativen Vermehrung der naiven auf Kosten der klassengewechselten B-Zellen im Vergleich zu gesunden Spendern aus. Diese Ergebnisse konnten wir gemeinsam mit der Arbeitsgruppe Schulze zur Wiesch vertiefen und so einen Zusammenhang zwischen der verminderten CD73 Expression auf B-Zellen von HIV Patienten mit der verminderten Fähigkeit dieser Zellen zum Klassenwechsel in-vitro aufzeigen (Kim et al. 2017). Des Weiteren habe ich untersucht, wie die CD73 Expression einer B-Zelle vom Lebensalter des Spenders und dem Differenzierungsgrad der B-Zelle abhängt. Ich konnte zeigen, dass die CD73 Expression auf B-Zellen bis zum jungen Erwachsenenalter zunimmt, um dann mit steigendem Alter wieder abzunehmen. Die maximale Expression findet auf reifen Naiven Zellen statt, während Zellpopulationen im Blut, die einen Antigenkontakt hatten, wieder deutlich weniger CD73 exprimieren. Außerdem konnte ich zeigen, dass unreife B-Zellen kaum CD73 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Diese Beobachtungen nahmen wir zum Anlass, die CD73 Expression unreifer B-Zellpopulationen detaillierter zu untersuchen. Während unreifere T1 und T2 transitionale B-Zellen noch kein CD73 exprimierten, konnte ich mit Hilfe von CD73 eine dritte Reifestufe von transitionalen B-Zellen identifizieren. Meine Daten legen nahe, dass T3 Zellen eine Zwischenstufe der Ausdifferenzierung von transitionalen zu reifen Naiven B-Zellen sein könnten. Diese These konnte ich durch die Erstellung eines minimalen Spannbaums mit SPADE weiter unterstützen. Trotzdem stützt sich diese Analyse bisher nur auf phänotypische Daten und sollte in Zukunft weiter untersucht werden. Zusammenfassend deuten meine Daten darauf hin, dass das Ektoenzym CD73 tatsächlich eine wichtige Rolle für die Reifung und Funktion von B-Lymphozyten spielt.

In this work I developed a panel for the flow-cytometric analysis of B lymphocyte subpopulations for the use in immunological diagnostics. The marker CD73, which expression levels on B cell subpopulations and role in B cell differentiation is not yet clear. This panel was used to monitor the expression of CD73 during peripheral B cell development and differentiation and to determine the diagnostic value of CD73 for evaluation of B cell maturation in different patient cohorts. The analysis of CD73 on B cells of HIV patients revealed that B cells of HIV patients expressed lower levels of CD73 than those of healthy donors. The changes in the composition of their B cell pool resembled those previously seen in CVID patients. The peripheral B cell pool of HIV patients showed increased levels of naive and decreased levels of class-switched B cells for instance. These results were enlarged upon together with the workgroup of Schulze zur Wiesch. This work then revealed a correlation between the diminished CD73 expression and aggravated class-switching in-vitro of B cells of HIV patients (Kim et al. 2017). Furthermore, I investigated the correlation between CD73 expression of B lymphocytes and the age of blood donors. I was able to show, that the expression of CD73 increases with age until early adulthood and decreases with further aging. The maximal expression of CD73 is found on mature naive cells, while cell populations in the blood, which had contact to antigens reduce their expression of CD73 with further differentiation. Additionally, we decided to investigate in CD73 expression of immature B cells, after I was able to show that these cells hardly express CD73 on their surface. While immature T1 und T2 transitional B cells did not express CD73 on their surface, we were able to describe a third maturation stage of transitional B cells based on their expression of CD73. My findings suggest that T3 cells could be an intermediate stage of maturation between immature transitional and mature naive B lymphocytes, which was underlined by further analysis using tSNE and SPADE. Nevertheless, this thesis is based on phenotypical data only up to now and should be pursued in the future. In summary my findings suggest that the ectoenzyme CD73 indeed plays a crucial role for maturation and function of B lymphocytes in humans.