Entwicklung und Validierung eines Massenspektrometrie-basierten Verfahrens zur Quantifizierung von CAAP48

Abstract

Die Behandlung von Sepsispatienten zählt aufgrund der Komplexität des Krankheitsbildes zu den größten Herausforderungen der modernen Intensivmedizin. Definiert ist Sepsis als durch eine fehlgeleitete Immunantwort ausgelöste lebensbedrohliche Organdysfunktion, wobei die Immunantwort ursächlich gegen eine Infektion gerichtet war. Die Behandlung erfolgt am effektivsten im Anfangsstadium, allerdings ist die Frühdiagnose der Sepsis schwierig. In der Folge kommt es zu dramatischen Krankheitsverläufen, die mit enormen Behandlungskosten, einer hohen Mortalität sowie gravierenden Spätfolgen verbunden sind. Bisher hat einzig Procalcitonin als Biomarker für Sepsis eine umfassende Verbreitung in der klinischen Routinediagnostik gefunden. Allerdings ist es nur eingeschränkt für die Frühdiagnose der Sepsis sowie für die Vorhersage der Schwere des Krankheitsverlaufs geeignet. Um die Mortalität von Sepsispatienten zu verringern, ist die Identifizierung und klinische Validierung neuer Biomarker zur Frühdiagnose daher von entscheidender Bedeutung. Im Blut von an Sepsis erkrankten Patienten erfolgt ein verstärkter proteolytischer Abbau des Akute-Phase-Proteins Alpha-1-Antitrypsin. Die Spaltung an dessen C-Terminus führt zur Freisetzung eines proteolytischen Peptids, welches als CAAP48 bezeichnet wird und dessen Konzentration im Blut von Sepsispatienten erhöht ist. Aus diesem Grund wird CAAP48 als Kandidat für einen sensitiven und spezifischen Sepsis-Biomarker angesehen. Allerdings ist zur Bestätigung dieser Annahme eine klinische Validierung unerlässlich. Voraussetzung für die klinische Validierung von CAAP48 ist ein robustes und verlässliches Quantifizierungsverfahren. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein Massenspektrometrie-basiertes Verfahren zur Quantifizierung von CAAP48 in Blutplasma entwickelt. Dazu gehörte zunächst die Etablierung einer kostengünstigen und schnellen Probenvorbereitungsmethode, die auf der Denaturierung der Plasmaprobe und anschließender Festphasenextraktion beruht. Für die eigentliche Quantifizierung wurden massenspektrometrische Methoden genutzt, da diese sowohl empfindlich als auch spezifisch sind und darüber hinaus umfassende molekulare Informationen über den Analyten liefern. Die Probenvorbereitungsmethode sowie die beiden massenspektrometrischen Quantifizierungsmethoden bilden gemeinsam das Quantifizierungs-verfahren für CAAP48. Um die prinzipielle Verwendbarkeit des Verfahrens für die Quantifizierung von CAAP48 in humanem Blutplasma nachzuweisen, war zum einen die Validierung in Anlehnung an die Kriterien der „Food and Drug Administration“ der USA sowie der Europäischen Arzneimittelbehörde und zum anderen die Analyse von Patientenmaterial notwendig. Letzteres wurde im Rahmen einer Diagnostikstudie mit Sepsispatienten einer Intensivstation der Universitätsmedizin Rostock erhoben. Die Studie wurde von der zuständigen Ethikkommission genehmigt und während der Durchführung erfolgte ein umfassendes Monitoring verschiedenster klinischer Parameter. Schließlich konnte CAAP48 in allen erhobenen Patientenproben quantifiziert werden. Die Ergebnisse der mit zwei verschiedenen massenspektrometrischen Verfahren durchgeführten Analysen waren vergleichbar. Sie deuten darauf hin, dass ein Anstieg der CAAP48-Konzentration im Blutplasma spezifisch für Sepsis ist. Allerdings sind weitere Studien mit größeren Patientenkohorten notwendig.

Due to its complex pathophysiology, the adequate treatment of patients with sepsis is one of the greatest challenges by which modern intensive care medicine is faced with. Sepsis is defined as a life-threatening organ dysfunction caused by a dysregulated host response to infection. It can be treated most effective in its early stages, but diagnosis is difficult at this time. As a consequence, many patients are affected by a dramatic disease progression leading to huge costs for the national health care systems, high mortality and severe long-term complications. To date, only Procalcitonin (PCT) is widely used in clinical routine as marker for sepsis. But its ability for early diagnosis and prediction of disease outcome is limited. In order to reduce the high mortality of sepsis patients, identification and clinical validation of new biomarkers are of tremendous importance. Within the blood of sepsis patients, the proteolytic degradation of the acute-phase protein alpha-1-antitrypsin is enhanced. Cleavage of its C-terminal section results in the release of a proteolytic fragment termed as CAAP48, which blood concentration is increased in sepsis patients. Therefore, CAAP48 has been recognized as a candidate for a sensitive and specific sepsis biomarker, but validation by clinical studies is necessary. A robust and reliable quantification procedure for CAAP48 is the basic prerequisite for its clinical validation. Consequently, the present work has focussed on the development and validation of a mass spectrometry-based assay for the quantification of CAAP48 in human blood plasma. In a first step, a fast and cost-effective sample preparation strategy based on sample denaturation and solid-phase extraction was established. The utilization of mass spectrometry for the quantification of CAAP48 seemed to be highly advantageous. Mass spectrometry is a very sensitive and specific analysis technique, able to unveil comprehensive information about the molecular status of CAAP48. Sample preparation strategy and mass spectrometry-based quantification methods are forming together the quantification assay. In order to proof the basic ability of the developed assay to quantify CAAP48 in patient material, validation of the assay according to the guidelines of the Food and Drug Administration and the European Medicines Agency as well as the analysis of patient material was necessary. The latter was acquired with the help of a diagnostic study, within which sepsis patients hospitalized at an intensive care unit of the University Medical Centre Rostock were enrolled. The diagnostic study was approved by the local ethics committee and during its implementation an extended set of clinical parameters was monitored. The assay enabled the quantification of CAAP48 in all patient samples. The outcome of the analyses with two different mass spectrometry techniques was comparable, showing that the assay is robust. Quantification results for CAAP48 indicate that an increase of its plasma concentration is specific for sepsis. But further studies with extended patient cohorts are necessary.