Identifizierung und Biogenese von tRNA Hälften in Brassicaceen

Abstract

Die Entdeckung von posttranskriptionellem Gen Silencing durch kleine regulatorische RNAs, führte zu der Entdeckung vieler verschiedener sRNA-Spezies. Ihre Beteiligung in sehr unterschiedlichen Prozessen diverser Organismen wurde sehr intensiv erforscht. In Pflanzen wurde gezeigt, dass viele von ihnen als Signalmoleküle systemisch über das Langstreckentransportsystem verbreitet werden und am Zielort wichtige Funktionen ausüben. Dies ist sehr wichtig für sessile Pflanzen, um schnell auf verschiedene Umwelteinflüsse reagieren zu können. Eine neue Klasse regulatorischer sRNAs wurde zunächst als Abbauprodukt deklariert. Mit der Zeit zeigte sich jedoch, dass eine spezifische Produktion der von gereiften und pre-tRNA abgeleiteten Fragmente stattfindet, die in fast allen Organismen identifiziert wurden. In Pflanzen kommen sie vor allem im Phloemsaft sehr abundant vor. Die Biogenese und physiologische Funktionen in Pflanzen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Im Zuge dieser Arbeit konnte eine Sequenzdatenbank von B. napus tRHs generiert werden, die sowohl die Komposition von tRHs im Phloemsaft unter Normalbedingungen als auch unter Trockenstressbedingungen enthält. Es wurden 67 verschiedene tRHs unter Normalbedingungen und 62 bei Trockenstress identifiziert, von denen waren 13 schwach reguliert durch Trockenstress. Weiterhin wurden zwei sehr abundante 5´tRHs identifiziert (5´tRH-Gly(UCC), 5´tRH-Glu(UUC)), die zusammen fast 75 % der tRHs ausmachen und daher für weitere Untersuchungen sehr interessante Kandidaten darstellen. Der Großteil aller tRHs stammte vom 5´Teil der tRNA ab, was auch häufig in anderen Studien gezeigt wurde. Untersuchungen hinsichtlich ihrer Funktion bei der Translation zeigten, dass native Phloemsaft-RNAs in der Lage sind die Translation zu hemmen. Dies wurde mit einer sehr sensitiven Messmethode mit Hilfe des Fluoreszenzproteins YFP und eines Plattenlesers zeitlich aufgelöst gezeigt. Anhand dieser Methode können verschiedene Substrate getestet werden, um einen genaueren Einblick zu erhalten, ob eine spezifische Hälfte oder tRNA dafür notwendig ist. Durch die erfolgreiche Herstellung von je zwei Homologen von RNS1, RNS2 und RNS3, aus Arabidopsis und Raps, konnte gezeigt werden, dass RNS2 sich hinsichtlich der Substrate im in vitro RNase Assay unterscheidet. Mit unseren Methoden konnte für RNS2, im Gegensatz zu RNS1 und RNS3, keine Aktivität hinsichtlich tRNAs gezeigt werden, rRNA konnte dagegen abgebaut werden, sowohl aus Blatt RNA als auch in vitro synthetisierte 18S rRNA. Der Eindruck, dass RNS2 anders agiert, bestätigte sich auch durch Northern Blots von rns2 Mutanten. Wenn RNS2 in Arabidopsis ausgeknockt war, konnte eine Akkumulation von Hälften beobachtet werden. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass RNS2 am Abbau von tRHs beteiligt ist, RNS1 und RNS3 dagegen tRHs generieren. Andere Studien zeigten dagegen, dass auch RNS2 tRNAs abbauen kann. Daher müssen weitere Untersuchungen mit Hilfe der rekombinanten RNasen zum Abbau von tRNA durchgeführt werden. Zu guter Letzt konnten phänotypische Analysen von Einzel- und Doppelmutanten von RNS1, RNS2 und RNS3 aus Arabidopsis Hinweise auf eine Funktion bei der Ausbildung der Vaskulatur für RNS1 und RNS3 zeigen. Nur die Doppelmutante rns1rns3 zeigte eine Reduktion der vaskulären Komplexität.

The discovery of transcriptional gene silencing by small regulatory RNAs led to the discovery of several other sRNA-species. Since then, their contribution to various processes of divers organisms has been studied intensely. In plants, many of this signalling molecules have been shown to be transported systemically via long-distance trafficking acting at their target location. For sessile plants, it is crucial to react quickly to multiple envorinmental conditions. Recently, new small regulatory acting RNAs derived from pre- and mature tRNAs have been found in many organisms, which were thought to be degradation products, in the beginning. However, these RNAs were shown to be specifically produced, mostly during stress. Though, under non-stress conditions they occur very abundant in the phloem sap of plants. However, their function and biogenesis in plants are not fully understood. In the course of this thesis, a comprehensive sequence-database of tRHs derived from mature tRNAs occuring in the phloem sap has been established, for plants grown under non-stress and drought-stress conditions. 67 different tRHs under non-stress conditions and 62 under drought-stress conditions could be identified. The most abundant tRHs are 5´tRH-Gly(UCC) and 5´tRH-Glu(UUC), which together represent almost 75 % of all identified tRHs and are of great interest for subsequent investigations. Most of the tRHs originate from the 5´part of tRNAs, which has already been shown for other organisms in some cases. The ability of phloem sap and native RNA isolated from phloem sap to inhibit protein synthesis could be confirmed. Therefor a new sensitive method using the fluorescent capacity of YFP has been established. This enabled a temporal measurement of the translation reaction by using a plate reader. Further experiments using this method could provide an insight into a suitable substrate for the inhibiting mechanism. Moreover, six recombinant T2 RNases could be purified, namely RNS1, RNS2 and RNS3 homologues of B. napus and A. thaliana and shown to be active. Interestingly our results indicate some differences regarding substrate specifity or activity. For RNS2 only an activity towards rRNA but not tRNA could be detected through our methods. This was detected using in vitro-transcribed 18S rRNA and whole RNA from Arabidopsis leaf tissue. Additionally, tRHs accumulate in rns2-, rns1rns2- and rns2rns3-knockout mutants, indicating a role in tRH decay for RNS2. In contrast, other studies showed an activity for RNS2 regarding tRNAs, also. Additional studies using recombinant T2 RNase generated during this thesis, will help to reveal the process of generating tRHs and the subsequent tRH decay. In the end, phenotypical analysis suggest an involvement of tRHs to develop vascular tissue, since rns1rns3 mutant plants showed a reduced vascular complexity.