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dc.contributor.advisorKehr, Julia (Prof. Dr.)
dc.contributor.authorJanus, Mareike
dc.date.accessioned2020-10-19T13:28:28Z-
dc.date.available2020-10-19T13:28:28Z-
dc.date.issued2020
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8447-
dc.description.abstractConventional function-based metagenome screenings are extremely time consuming, expensive and laborious. Current approaches for screening of metagenomic libraries have several limitations that still do not allow this technology to access the large enzyme variety of a metagenome (Beloqui et al., 2008; Ferrer et al., 2009; Nevondo, 2016). Thereby, the heterologous protein expression in a suitable host is the most limiting factor in function-based metagenomics. For library construction, recombinant protein expression and the screening for a specific desired function, E. coli-based systems are still the first choice despite the well-known problems of protein expression in bacterial host systems. Several studies are indicating that the expression of metagenomic-derived genes in E. coli is limited to about 40% (Gabor et al., 2004; McMahon et al., 2012; Felczykowska et al., 2015). A cell-free protein synthesis (CFPS) system should overcome many limitations associated with heterologous protein expression, representing a promising alternative to conventional function-based screening methods, being host-independent, time-saving and less labor-intensive. The focus of this cell-free expression system, whose initial experiments are carried out in this work, is the in vitro transcription and translation of “thermozymes”, for which there is a high demand for industrial bioprocesses, that require elevated temperatures to take place (DeCastro et al., 2016; Mirete et al., 2016). To improve the transcription of metagenomic genes, a bacterial RNA polymerase (RNAP) from the extreme-thermophile bacterium Thermus thermophilus (T. thermophilus) and a new, viral metagenome-derived RNAP (RNAPE) were cloned, heterologously expressed and purified. In vitro transcription assays were carried out using both RNAPs, whereas only with the RNAPE mRNA could be synthesized. This new RNAP was discovered using sequence-based metagenomic analysis of a microbial community from elephant feces and could be expressed heterologously with His6-tag in E. coli BL21. The purification using IMAC resulted in up to 200 mg protein/l cell culture. The RNAPE is characterized by having only an identy of 29% in amino acid sequence compared to the T7 RNAP, but shows comparable preferences regarding assay conditions with an equeal level of transcriptional activity on a broad variety of DNA templates. Within this work, in vitro transcriptions with (i) uncloned, genomic DNA from different bacteria as found in a metagenome, as well as (ii) fosmids from a metagenomic library and (iii) metagenomic-derived genes coding for already characterized enzymes, were successfully carried out. To capture the broad spectrum of potential new biocatalysts in a metagenome, in vitro expression experiments were performed based on cell extracts from various bacteria, both gram-negative and gram-positive strains. In addition to the commonly used extract of E. coli (using the strains (1.) MRE600 and (2.) CodonPlus RIL), robust cell extracts from the psychrophilic bacterium (3.) Pseudomonas antarctica, a mesophile (4.) Bacillus subtilis strain, two thermophile Geobacillus species, the inhouse designed strain (5.) Geobacillus sp. GHH01 and (6.) Geobacillus thermoleoverans, as well as from the thermophile strain (7.) Chelatococcus sambhunathii and the hyper-thermophile (8.) T. thermophilus were prepared. These should improve the expression of proteins, that need special conditions like extreme temperatures, to be active. CFPS with extracts from the Geobacillus species, as well as from Pseudomonas antartica could successfully been demonstrated for the first time in this work. Unfortunately, in vitro translations with cell extracts from B. subtilis, C. sambhunathii and T. thermophilus were without success. Model experiments were carried out with already characterized enzymes of metagenomic origin as target proteins. Heat-tolerant hydrolases, whose demand for industrial applications has been increasing rapidly in recent years, were successfully expressed in vitro, including metagenomic-derived, thermostable lipases from the hyperthermophilic archaeon Ignicoccus hospitalis (Kobus et al., 2019) and recently published polyethylene terephthalate (PET)-degrading hydrolases (Danso et al., 2018). Finally, the -in this work- designed CFPS system was successfully tested for compatibility with advanced in vitro compartmentalization. By coupling CFPS packed into polymersomes and fluorescence-activated cell sorting (FACS) techniques, a new in vitro-based technique can be designed to overcome the low throughput rate of classical function-based metagenomic screening.en
dc.description.abstractKonventionelle funktions-basierte Metagenomscreenings sind extrem zeitaufwändig, teuer und mühsam. Die derzeitigen Ansätze für das Screening von Metagenombibliotheken unterliegen diversen Limitierungen, die es dieser Technologie bislang nicht ermöglichen, auf die große Enzymvielfalt eines Metagenoms zuzugreifen (Beloqui et al., 2008; Ferrer et al., 2009; Nevondo, 2016). Dabei ist die heterologe Proteinexpression in einem geeigneten Wirtsorganismus der limitierendste Faktor. E. coli-basierte Systeme sind -trotz der bekannten Probleme der Proteinexpression in bakteriellen Wirtssystemen- noch immer die erste Wahl für Metagenomscreenings. Diverse Studien weisen darauf hin, dass die Expressioneffizienz metagenomisch abgeleiteter Gene in E. coli auf etwa 40% begrenzt ist (Gabor et al., 2004; McMahon et al., 2012; Felczykowska et al., 2015). Ein zellfreies Proteinsynthesesystem (CFPS) soll die Schwierigkeiten, die mit der heterologen Expression von Proteinen metagenomischen Ursprungs verbunden sind, überwinden und eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen funktionsbasierten Screeningmethoden darstellen. Das System ist unabhängig vom Wirtorganismus, zeitsparend und weniger arbeitsintensiv. Der Fokus dieses zellfreien Expressionssystems, dessen erste Experimente in dieser Arbeit durchgeführt wurden, liegt auf der in vitro Transkription und Translation von „Thermozymen“. Für diese thermoresistenten Enzyme besteht ein hoher Bedarf für die Anwendung in industriellen Bioprozessen, die erhöhte Reaktionstemperaturen erfordern (DeCastro et al., 2016; Mirete et al., 2016). Um die Transkription metagenomischer Gene zu verbessern, wurde eine bakterielle RNA-Polymerase (RNAP) aus dem extrem thermophilen Bakterium Thermus thermophilus und eine neue, virale RNAP metagenomischen Ursprungs (RNAPE) kloniert, heterolog exprimiert und gereinigt. In vitro Transkriptionsversuche wurden unter Verwendung beider RNAPs durchgeführt, während lediglich mit der RNAPE mRNA synthetisiert werden konnte. Diese RNAPE wurde mittels sequenzbasierter Analyse eines Metagenoms der mikrobiellen Gemeinschaft in Elefantenkot entdeckt und konnte heterolog mit His6-Tag in E. coli BL21 exprimiert werden. Die Reinigung mittels IMAC resultierte in bis zu 200 mg Protein/l Zellkultur. Die RNAPE zeichnet sich durch eine Aminosäuresequenzähnlichkeit von 29% im Vergleich zur T7 RNAP aus und zeigt vergleichbare Präferenzen hinsichtlich der Reaktionsbedingungen und eine vergleichbar effiziente Transkriptionsaktivität mit einer breiten Vielfalt von DNA-Templates. In dieser Arbeit wurden erfolgreich in vitro Transkriptionen mit (i) ungeklonter, genomischer DNA verschiedener Bakterienstämme, wie sie typischerweise in einem Metagenom vorliegt, sowie (ii) Fosmiden aus einer Metagenombibliothek und (iii) von Genen metagenomischen Ursprungs, die für bereits charakterisierte Enzyme kodieren, durchgeführt. Um das breite Spektrum potenzieller neuer Biokatalysatoren in einem Metagenom einzufangen, wurden in vitro Translationsexperimente durchgeführt, die auf Zellextrakten verschiedener Bakterien, sowohl gram-negativer als auch gram-positiver Stämme, basieren. Zusätzlich zu dem üblicherweise verwendeten Extrakt von E. coli (die Stämme (1.) MRE600 und (2.) CodonPlus RIL) wurden robuste Zellextrakte aus dem psychrophilen Bakterium (3.) Pseudomonas antarctica, einem mesophilen (4.) Bacillus subtilis-Stamm, zweier thermophiler Geobacillus-Stämme, dem hauseigens entwickelten Stamm (5.) Geobacillus sp. GHH01 und (6.) Geobacillus thermoleoverans, sowie aus dem thermophilen Stamm (7.) Chelatococcus sambhunathii und dem hyper-thermophilen (8.) Thermus thermophilus präpariert. Diese sollten die Expression von Proteinen implementieren, die spezielle Bedingungen wie extreme Temperaturen benötigen, um aktiv zu sein. So konnte in dieser Arbeit erstmals erfolgreich die CFPS mit Extrakten aus Geobacillus sowie aus Pseudomonas antartica gezeigt werden. Leider blieben in vitro Translationen mit Zellextrakten aus B. subtilis, C. sambhunathii und T. thermophilus erfolglos. Modellexperimente mit bereits charakterisierten Enzymen metagenomischen Ursprungs als Zielproteine wurden durchgeführt. Hitzestabile Hydrolasen, deren Nachfrage für die industrielle Anwendung in den letzten Jahren rapide zugenommen hat, wurden erfolgreich in vitro exprimiert. Dazu gehören thermostabile Lipasen aus dem hyperthermophilen Archaeon Ignicoccus hospitalis (Kobus et al., 2019) und kürzlich publizierte Polyethylenterephthalat (PET) abbauende Hydrolasen (Danso et al., 2018). Schließlich wurde das in dieser Arbeit entwickelte CFPS-System erfolgreich auf Kompatibilität mit fortschrittlicher in vitro-Kompartimentierung getestet. Durch die Kopplung von in Polymersomen verpacktem CFPS und FACS kann eine neue in vitro-basierte Technologie entwickelt werden, um die Problematik geringer Durchsatzraten im klassischen, funktions-basierten Metagenomscreening zu lösen.de
dc.language.isoenen
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.subjectTranslationde
dc.subjectCFPSde
dc.subjectzellfreies Metagenomscreeningde
dc.subjectMikrofluidikde
dc.subjectMetagenomics Biotechnology transcription translation CFPSen
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften, Biologie
dc.titleDevelopment of a combined in vitro transcription and translation system for rapid cell-free screening of metagenomic DNAen
dc.title.alternativeEntwicklung eines kombinierten In-vitro-Transkriptions- und Translationssystems für das schnelle, zellfreie Screening metagenomischer DNAde
dc.typedoctoralThesis
dcterms.dateAccepted2020-06-19
dc.rights.ccNo license
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subject.bcl35.71 Biochemische Methoden
dc.subject.bcl35.73 Biochemische Reaktionen
dc.subject.bcl42.20 Genetik
dc.subject.bcl42.30 Mikrobiologie
dc.subject.bcl58.30 Biotechnologie
dc.subject.gndMetagenomik
dc.subject.gndBiotechnologie
dc.subject.gndGenetik
dc.subject.gndTranskription
dc.subject.gndProteinbiosynthese
dc.subject.gndEnzym
dc.subject.gndPolymerasen
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.thesisdoctoralThesis
tuhh.opus.id10558
tuhh.opus.datecreation2020-07-23
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentBiologie
thesis.grantor.placeHamburg
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburg
dcterms.DCMITypeText-
tuhh.gvk.ppn1726525953
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-105586
item.languageiso639-1other-
item.creatorOrcidJanus, Mareike-
item.grantfulltextopen-
item.creatorGNDJanus, Mareike-
item.advisorGNDKehr, Julia (Prof. Dr.)-
item.fulltextWith Fulltext-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
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