Characterization of NETotic neutrophils as a novel tool for autoimmune disease diagnostics

Abstract

Neutrophils granulocytes are the most common and, arguably, the most important front-line immune cell of the human body. They represent a crucial part of the innate immune system, capable of important functions in protecting the body from foreign intruders. They can also produce NETs, which are formed in a unique way of cell death, discovered in 2004 and classified as an additional form of cell death next to apoptosis and necrosis (Brinkmann et al. 2004, Fuchs et al. 2007). NETs have recently been associated with autoimmune diseases (Pinegin et al. 2015, Lee et al. 2017). However, the role which NETs play in the pathophysiology of these diseases, and the consequences of these findings, largely remains unclear. Neutrophils are already used as a substrate to detect ANCA which are associated with small-vessel vasculitis. However, the detection of ANCA is based on the screening of patient sera using indirect immunofluorescence on ethanol-fixed unstimulated neutrophils. This thesis shows, that NETosis has three distinct stages and NETotic neutrophils can be used as substrate for ANCA testing. We also demonstrated, that NETosis generates neo-autoantigens. These neo-autoantigens develop over time in stimulated neutrophils and the frequency is affected by different stimuli. Also, the autoantigen generation is dependent on specific neutrophil enzymes. Furthermore, we detected antibodies against stimulated neutrophils in patient sera with suspected autoimmune disease and other preformed antibodies such as ANCA and ANA. These new antibodies stain stimulated neutrophils in distinct patterns analogous to the different staining patterns of ANCA. In conclusion, these results suggest that antibodies against activated neutrophils could play a role in the previously mentioned linkage between NETs and autoimmunity and are deserving of further investigation in the future. Further studies should investigate serum samples of patients with an already diagnosed autoimmune disease associated to neutrophils (e.g. GPA, MPA, EPA). Furthermore, the molecular target of antibodies against NETs should be identified and an ELISA with the targets of ASNA should be established.

Neutrophile Granulozyten sind die häufigsten und vermutlich eine der wichtigsten Abwehrzellen des menschlichen Körpers. Sie repräsentieren einen der bedeutsamsten Teile des angeborenen Immunsystems, welche eine Vielzahl von Funktionen ausübt, um den Körper vor fremden Eindringlingen zu beschützen. Sie können NETs produzieren, welche in einer einzigartigen Form des Zelltods entstehen und nach deren Entdeckung im Jahre 2004 als zusätzliche Form des Zelltods neben Apoptose und Nekrose klassifiziert wurde (Fuchs et al. 2007, Brinkmann et al. 2004). NETs werden zunehmend mit Autoimmunerkrankungen assoziiert (Pinegin et al. 2015, Lee et al. 2017). Die genaue Rolle, die NETs in der Pathophysiologie dieser Erkrankungen spielt und die Konsequenzen dieser Assoziationen bleiben größtenteils unklar. Neutrophile werden bereits als Substrat für ANCA Diagnostik genutzt, welche mit Vaskulitiden der kleinen Gefäße assoziiert sind. Die Detektion von ANCA basiert auf indirekter Immunfluoreszenz auf unstimulierten, Ethanol fixierten neutrophilen Granulozyten. Diese Doktorarbeit zeigt, dass NETose drei separate Phasen aufweist und NETotische Neutrophile als Substrat auf ANCA Diagnostik genutzt werden können. Wir zeigen ebenfalls, dass NETose neo-Autoantigene produziert. Diese neo-Autoantigene entwickeln sich im Verlauf der NETose und die Frequenz dieser Antigene wird durch unterschiedliche Stimulantien beeinflusst. Weiterhin ist die Entstehung von Autoantigenen abhängig von bestimmten neutrophilen Enzymen. Zusätzlich konnten wir Antikörper gegen stimulierte Neutrophile in Patientenseren detektieren, welche den Verdacht auf eine systemische Autoimmunerkrankung hatten und für ANCA oder ANA untersucht wurden. Diese neuen Autoantikörper lassen sich auf stimulierten Neutrophilen nachweisen und weisen ein spezifisches Färbemuster auf, welche analog zu der ANCA Klassifizierung eingeordnet werden kann. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse an, dass Antikörper gegen stimulierte Neutrophile eine Rolle in dem vorher erwähnten Zusammenhang zwischen NETs und Autoimmunität spielen könnten und dies weiterer Untersuchungen bedarf. Künftige Analysen sollten Seren von Patienten mit bereits diagnostizierten Erkrankungen Untersuchen, die mit ANCA assoziiert sind (bspw. GPA, MPA, EPA). Weiterhin sollten die molekularen Epitope der Antikörper gegen NETs identifiziert werden, um einen entsprechenden ELISA entwickeln zu können.