Mechanistical insights into the role of importin-α7 and ANP32 proteins on influenza A virus replication and pathogenicity in mammals

Abstract

Influenza A viruses (IAV) occasionally transmit from their natural reservoir via intermediate hosts to mammals, including humans. Here, the virus can cause severe and even fatal respiratory disease, posing a major health threat to the human population. Thus, deciphering the complex and dynamic virus-host interactions is essential for the development of effective countermeasures to prevent severe influenza in humans, as well as for pandemic preparedness. This study aimed to provide mechanistical insights in the function of two major host factors that have been implicated to drive IAV interspecies transmission and pathogenicity in mammals: Importin-α7, a member of the cellular nuclear import machinery, and ANP32. Importantly, the detailed mode-of-action underlying the function of these key host factors during influenza infection is still largely unknown. For importin-α7, it was proposed before that it indirectly promotes human-type (PB2 627K) polymerase activity by regulating the subcellular localization of other host cell factors. To address this hypothesis, the human importin-α7 interactome was determined in this study using an unbiased proteomic approach. Coupled with fluorescence microscopy, ANP32A was identified as a cellular cargo protein that uses specifically importin-α7 for nuclear import. However, using a combined gain- and loss-of-function viral polymerase activity assay, it could be demonstrated that importin-α7 and ANP32A unfold functionally-independent and spatially-separated mode of actions in promoting PB2 627K IAV replicative fitness in human cells. Importantly, the role of ANP32 proteins during influenza infection has been mostly studied using in vitro cell culture systems. To address the question whether these host cell factors also promote human-type IAV replication and pathogenicity in vivo, a genetically modified knockout mouse model was used. Surprisingly, virus tropism, innate immune responses or disease outcome was not affected in IAV infected ANP32A knockout mice, compared to their wild type littermates. On the other hand, infection of mice lacking the ANP32B gene (ANP32B-/-) with seasonal H3N2 or highly-pathogenic avian H5N1 IAV resulted in significantly reduced viral loads, pro-inflammatory immune responses and, in turn, increased survival upon otherwise lethal IAV challenge. Genome-wide transcriptome analyses further uncovered a global switch towards an anti-inflammatory state in IAV infected ANP32B-/- mice, indicating that ANP32B might be a novel key regulator of inflammation and immunity in mice, and perhaps also in humans. In conclusion, the findings presented here suggest that targeting importin-α7, ANP32B or their regulated cellular pathways might present a novel approach to treat severe influenza in humans, by inhibiting viral replication and/or preventing virus-induced immunopathology.

Influenza-A-Viren (IAV) können mittels Interspeziestransmission von ihrem natürlichen Reservoir über Zwischenwirte auf Menschen übergehen, wo das Virus schwere oder sogar tödliche Atemwegserkrankungen verursachen kann. Die Analyse der komplexen und dynamischen Virus-Wirt-Wechselwirkungen ist daher für die Entwicklung wirksamer Medikamente zur Behandlung einer schweren Influenza beim Menschen sowie für die Vorbereitung auf Pandemien von entscheidender Bedeutung. Die vorliegende Studie zielte daher darauf ab, mechanistische Einblicke in die Funktion von zwei Wirtszellfaktoren zu liefern, welche hauptsächlich zur Interspeziestransmission und Pathogenese von IAV in Säugetieren beitragen: Importin-α7, eine Komponente der zellulären Kernimportmaschinerie, sowie ANP32-Proteine. Für Importin-α7 wurde zuvor postuliert, dass es indirekt die Polymeraseaktivität von human-adaptierten (PB2 627K) IAV fördert, indem es die subzelluläre Lokalisation anderer Wirtszellfaktoren reguliert. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde in dieser Studie das humane Importin-α7-Interaktom mittels Massen-Spektrometrie bestimmt. Mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie konnte schließlich ANP32A als ein zelluläres Protein identifiziert werden, welches spezifisch Importin-α7 für den Kernimport nutzt. Unter Verwendung eines neu-etablierten Assays zur Bestimmung der viralen Polymeraseaktivität konnte jedoch gezeigt werden, dass Importin-α7 und ANP32A die replikative Fitness von PB2 627K-adaptierten IAV in humanen Zellen sowohl funktionell als auch räumlich unabhängig voneinander regulieren. Bis heute ist unbekannt, ob die ANP32-Proteine, welche bisher primär in Zellkultur studiert wurden, auch die Replikation und Pathogenese von IAV in vivo unterstützen. In dieser Studie konnte jetzt gezeigt werden, dass der Knockout von ANP32A in der Maus keinen Einfluss hat auf den Virustropismus, die Immunantwort oder den Krankheitsverlauf. Im Gegensatz dazu führte die Infektion von ANP32B-defizienten Mäusen mit saisonalen H3N2 oder hoch-pathogenen H5N1 IAV zu einer signifikant verringerten Viruslast, einer stark reduzierten Immunantwort und in der Folge eine erhöhte Überlebensrate der infizierten Mäuse. Genomweite Transkriptomanalysen konnten außerdem zeigen, dass der Knockout von ANP32B das Immunsystem in einen anti-inflammatorischen Zustand versetzt. Dies deutet darauf hin, dass ANP32B eine bisher unbekannte Schlüsselfunktion bei der Regulation der antiviralen Immunität in Mäusen und möglicherweise auch im Menschen einnehmen könnte. Zusammenfassend legen die hier vorgestellten Ergebnisse nahe, dass Importin-α7, ANP32B sowie deren regulierte Signalwege neue Ziele für die therapeutische Behandlung von schweren Influenza-Infektionen im Menschen darstellen könnten.