Towards establishment of model organisms for conjugating green algae – Zygnematophyceae and studies on the evolution of the regulatory network of the plant hormone cytokinin

Abstract

Cytokinine (CK) sind wichtige endogene Signalmoleküle, die das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen regulieren und ebenfalls Bedeutung für die Anpassung an Umweltbedingungen besitzen. Die Wirkung von CK wird bei Landpflanzen durch ein komplexes regulatorisches Netzwerk bestehend aus CK-Biosynthese, Metabolismus, Transport, Signalperzeption und Signalweiterleitung realisiert. Dieses regulatorische System wurde ausgiebig bei den Modellorganismen für Landpflanzen, (v.a. Arabidopsis thaliana sowie ebenfalls für das Laubmoos Physcomitrella patens) untersucht. Das drzeitige Verständnis des evolutionären Ursprungs sowie der evolutionären Entwicklung des CK-Systems ist lediglich fragmentarisch. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Vorkommen von CK Metaboliten sowie das regulatorische Netzwerk der CK bei charophytischen Grünalgen (CGA) untersucht. Das CK Profil der ausgewählten CGA Species (Cosmarium crenatum var. boldtianum, Micrasterias radians var. evoluta, Spirogyra pratensis, Klebsormidium nitens, and Mesostigma viride) zeigten eine Dominanz von Metaboliten aus den Isopentenyladenin (iP)- und cis-Zeatin (cZ) Familien, die als freie Basen, Riboside und Nukleotide vorlagen. CK-Glykoside wurden nicht bzw. nur im Spurenbereich detektiert. Im Kulturverlauf wurde festgestellt, dass die untersuchten Vertreter der CGAs endogen produzierte CK ins Kulturmedium abgeben. BLAST Analysen in Transkriptomen und Genomen von Algen und Landpflanzen zeigten die durchgehende Anwesenheit von Genen für Biosynthese und Transport in der gesamten grünen Linie der Pflanzen. Hingegen waren Gene, die für den metabolischen Weg der Cytokinindeaktivierung mittels Cytokininoxidase/dehydrogenase kodieren, ausschließlich bei Landpflanzen nachweisbar. Die bioinformatischen Analysen ergaben weiterhin, dass die CGA Vertreter, vergleichbar mit den Landpflanzen, komplette Sets von Genen für CK-Signalperzeption und Weiterleitung besitzen. CHASE-Domäne enthaltende Histidinkinasen (CHKs) sowie Typ-A Response Regulatoren scheinen erstmals bei CGAs vorzukommen. Eine Domänen-basierte phylogenetische Analyse ergab, dass die CGA-Genome sowohl Vertreter von kanonischen als auch von nicht-kanonischen CHKs als potentielle CK Rezeptoren enthalten. Für zwei CHKs der Schraubenalge Spirogyra pratensis (Transeau) (Zygnematales) (SpCHK1 und -2) wurden funktionelle Untersuchungen durchgeführt. SpCHK2, welches Ähnlichkeiten zu den kanonischen CHKs aufweist, zeigte eine leichte Affinität gegenüber iP in einem bakteriellen CK-Bindunsgstest. Beide SpCHKs konnten in Komplementationsversuchen mittels Überexpression in Rezeptormutanten des Laubmooses Physcomitrella patens keine Reversion des Phänotyps auslösen. Zusammenfassend ergaben die Untersuchungen, dass das Zweikomponenten-CK-Signaltransduktionssystem erstmals in der CGA Linie etabliert wurde. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass seine Funktionalität im Gegensatz zu Landpflanzen nicht oder nur zu einem geringen Teil an die Bindung von CK Liganden gekoppelt ist. Die Bedeutung von Zygnematophyceen (Jochalgen) als direkte Schwestergruppe der Landpflanzen wurde hinsichtlich evolutionärer und physiologischer Studien erörtert, wobei die Notwendigkeit der Etablierung von CGA Modellorganismen deutlich wird. Der derzeitige Forschungsstand zum Thema Modellorganismen für Zygnematophyceae wird zusammenfassend dargestellt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Organismen (Micrasterias radians var. evoluta (W.B.Turner) and Spirogyra pratensis) aus der Algensammlung MZCH (Microalgae and Zygnematophyceae Collection Hamburg) für Transgeneseexperimente ausgewählt. Für M. radians var. evoluta wird die effiziente transiente Transformation mittels via Gen-Kanone und Polyethylenglycol (PEG)-vermittelter Protoplastentransformation dargelegt. Mittels Protoplastentransfromation wurde der Einfluss verschiedener Promotoren auf die Transformationseffizienz untersucht. Die weitere Standardisierung von Kulturverfahren von Zygnematophyceen incl. des in-vitro Vollzugs des Lebenszyklus, die Etablierung von Transgenese-Protokollen und Sequenzresourcen werden es künftig ermöglichen, unser evolutionäres Verständnis zur Anpassung von Pflanzen an terrestrische Lebensbedingungen zu erweitern.

The cytokinins (CKs) are important signaling molecules regulating plant growth and development as well as responses to environmental stresses. Their actions in land plants are executed via a complex regulatory network of CK biosynthesis, metabolism, transport, signal perception, and transduction. In land plants this regulatory network has been well studied for the model organisms Arabidopsis thaliana and the bryophyte Physcomitrella patens. However, knowledge about the origin and evolutionary trajectory of the CK regulatory system is rather limited. In this thesis, the occurrence of CKs and their regulatory network in charophyte green algae (CGA) have been investigated. The CK profiles of five selected CGA species (Cosmarium crenatum var. boldtianum, Micrasterias radians var. evoluta, Spirogyra pratensis, Klebsormidium nitens, and Mesostigma viride) showed a predominance of isopentenyladenine (iP)- and cis-zeatin (cZ)- type CKs in free base, riboside, and phosphate forms, whereas glucosides did not contribute to the algal CK pools. Species from CGA were found to release endogenously produced CKs into the culture medium over the growth period. Correspondingly, BLAST searches of algal and plant genomic and transcriptomic databases indicated the presence of CK biosynthesis and transport across the green lineage, while the CK oxidase/dehydrogenase (CKX) mediated CK breakdown is restricted to land plants. I also found that a complete set of components involved in CK signaling can only be found in CGA and land plants. The CHASE-containing histidine kinases (CHKs) and type-A response regulators seem to first appear in CGA. A domain-based phylogenetic analysis revealed that the CGA genomes encode CHKs related to both, canonical and noncanonical CK receptors. Functional analysis was carried out for two CHKs from Spirogyra pratensis (Transeau) (Zygnematales) (SpCHKs). The SpCHK2, which is closely related to canonical CK receptors, showed weak affinity to iP in a bacterial CK binding assay. However, both SpCHKs were not able to activate a CK response when expressed in a CHK receptor-deficient mutant of the moss Physcomitrella patens. Our study provided hints that the two-component CK signaling pathway has first been acquired in CGA but it is likely to function in a manner independent or less dependent on the CK ligand when compared to land plants. The importance of Zygnematophyceae, the direct sister group of land plants, is discussed with respect to evolutionary and physiological studies, where the urgent need for the establishment of model organisms within this class becomes evident. The current development of model organisms in Zygnematophyceae is reviewed. By own work, two candidates (Micrasterias radians var. evoluta (W.B.Turner) and Spirogyra pratensis) were selected from the Microalgae and Zygnematophyceae Collection Hamburg (MZCH). Both organisms are able to perform their complete life cycle in vitro. Efficient transient transgene expression in M. radians var. evoluta via particle bombardment and polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation is presented. Via protoplast transformation the influence of various promoters on transformation efficiency was compared. Further establishment of transgenesis protocols and genetic resources together with the in vitro control of the life cycle will help to elucidate the processes which enabled the ancestors of extant Zygnematophyceae to adapt to terrestrial environments.