Modifikation des ATP-abhängigen Ca²⁺-Anstieges in Alveolarepithelzellen Typ II durch Streptococcus pneumoniae

Abstract

Die Pneumonie bleibt weiterhin im ambulanten wie auch im klinischen Bereich eine häufige Erkrankung. S. pneumoniae ist weltweit ihr häufigster Erreger. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von S. pneumoniae mit Alveolarepithelzellen untersucht. ATP ist in diesem Zusammenhang, z.B. bei Zell-Stress und Apoptose ein wichtiger auto- und parakriner Mediator, der Agonist an Purinrezeptoren ist. Um diesen Signaltransduktionsweg und die mögliche Beeinflussung durch S. pneumoniae zu untersuchen, wurden fluoreszenzmikroskopische Messungen der zytosolischen Ca²⁺-Konzentration von A549- und R3/1- Zellen durchgeführt. Die Charakterisierung der am Ca2+-Signal beteiligten Purinrezeptoren erfolgte unter anderem durch Verwendung verschiedener Agonisten. Purinrezeptor DNA wurde in der PCR bestimmt und Rezeptorproteine im Westernblot. Die zelluläre Lokalisation des Rezeptors gelang mit Hilfe konfokalmikroskopischer Aufnahmen lebender A549-Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der purinergen Signaltransduktion von Alveolarepithelzellen P2Y2-Rezeptoren eine zentrale Rolle spielen. Die Erhöhung der extrazellulären ATP- bzw. UTP-Konzentration aktiviert P2Y2-abhängige Signalkaskaden, die zu einer Erhöhung der zytosolischen Ca²⁺-Konzentration führen. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass dieser Vorgang durch S. pneumoniae inhibiert werden kann. In einem weiteren Schritt gelang mit Hilfe konfokalmikroskopischer Aufnahmen der Nachweis der zytosolischen P2Y2-Rezeptor-Relokalisation während der Inkubation der Zellen mit Pneumokokken. Die physiologisch eher membranständig zu findenden P2Y2-Rezeptoren konnten nach Inkubation mit S. pneumoniae vermehrt im Zytosol nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass S. pneumoniae in der Lage ist, die für Alveolarepithelzellen wichtige purinerge Signaltransduktion und damit auch die zytosolische Ca²⁺-Konzentration ([Ca²⁺]zyt) zu beeinflussen. Dies geschieht höchstwahrscheinlich durch eine Inaktivierung und/ oder Internalisierung von P2Y2-Rezeptoren. Die Balance zwischen Flüssigkeitssekretion und Resorption wird stark von der extrazellulären ATP-Konzentration beeinflusst. ATP und zytosolisches Ca2+ sind auch für die Exkretion von Surfactant von zentraler Bedeutung (Dietl et al. 2012). Sowohl die Exozytose als auch die extrazelluläre Prozessierung von Surfactant sind abhängig von der [Ca²⁺]zyt (Schmid et al. 2011)(Okada et al. 2006)(Bove et al. 2010)(Bhattacharya & Matthay 2013). Um die klinische Relevanz der in dieser Arbeit dargestellten Zusammenhänge richtig einordnen zu können, müssen noch weitere Versuche durchgeführt werden, die den Einfluss von S. pneumoniae auf andere biochemische Vorgänge, z.B. die Sekretion von Surfactant oder die Zilien Motilität untersucht. In einem nächsten Schritt wäre es auch denkbar, die Versuche an isolierten humanen Alveolarepithelzellen zu wiederholen. Die Kontrolle über die alveoläre Flüssigkeits-Homöostase ist für viele Funktionen der Lunge genauso wichtig wie die Kontrolle über Surfactantproduktion, -exkretion und –prozessierung (Dietl et al. 2012). S. pneumoniae ist in der Lage, eine hierfür wichtige Signaltransduktion zu beeinflussen. Eine geringere Surfactantproduktion und eine veränderte Flüssigkeitsresorption und Sekretion behindern eine effektive Bekämpfung von Bakterien und geben S. pneumoniae einen Überlebensvorteil (Mason 2006), (Fehrenbach 2001). Das Bakterium kann auf diese Weise atelektatische Bereiche in der Lunge bilden und die mukoziliäre „clearance“ behindern.

Pneumonia remains a common disease in both the outpatient and clinical settings. S. pneumoniae is its most common pathogen worldwide. In this thesis the interaction of S. pneumoniae with alveolar epithelial cells was investigated. ATP is an important auto- and paracrine mediator in this context, e.g. in cell stress and apoptosis, and is an agonist at purine receptors. To investigate this signal transduction pathway and the possible influence of S. pneumoniae, fluorescence microscopic measurements of the cytosolic Ca²⁺ concentration of A549 and R3/1 cells were performed. The characterization of the purine receptors involved in calcium signalling was performed by using different agonists. Purine receptor DNA was determined in PCR and receptor proteins in Western blot. The cellular localization of the receptor was achieved by confocal microscopy of living A549 cells. It could be shown that P2Y2 receptors play a central role in the purinergic signal transduction of alveolar epithelial cells. The increase of the extracellular ATP or UTP concentration activates P2Y2-dependent signalling cascades that lead to an increase of the cytosolic Ca²⁺ concentration. It has also been shown that this process can be inhibited by S. pneumoniae. In a further step, confocal microscopic images were used to detect cytosolic P2Y2 receptor relocalization during incubation of the cells with pneumococci. After incubation with S. pneumoniae, the physiologically more membrane-bound P2Y2 receptors could be detected in the cytosol. These results show that S. pneumoniae is able to influence the purinergic signal transduction, which is important for alveolar epithelial cells, and thus also the cytosolic Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺]cyt). This most likely occurs through inactivation and/or internalization of P2Y2 receptors. The balance between fluid secretion and absorption is strongly influenced by the extracellular ATP concentration. ATP and cytosolic Ca2+ are also of central importance for the excretion of surfactant (Dietl et al. 2012). Both exocytosis and extracellular processing of surfactant are dependent on the [Ca²⁺]cyt (Schmid et al. 2011)(Okada et al. 2006)(Bove et al. 2010)(Bhattacharya & Matthay 2013). In order to correctly classify the clinical relevance of the correlations presented in this work, further experiments have to be conducted to investigate the influence of S. pneumoniae on other biochemical processes, e.g. the secretion of surfactant or ciliary motility. In a next step it should also be considered to repeat the experiments on isolated human alveolar epithelial cells. Control of alveolar fluid homeostasis is as important for many lung functions as control of surfactant production, excretion and processing (Dietl et al. 2012). S. pneumoniae is able to influence the specific signal transduction pathway, which is important for this purpose. Reduced surfactant production and altered fluid absorption and secretion hinder effective bacterial control and gives S. pneumoniae a survival advantage (Mason 2006), (Fehrenbach 2001). The bacterium can thus form atelectatic areas in the lung and impede mucociliary clearance