Identification of novel parasitophorous vacuole proteins in P. falciparum parasites using BioID

Abstract

Malaria pathology is caused by the asexual replication of Plasmodium spp. within red blood cells. Among the five Plasmodium species that infect humans P. falciparum is responsible for the severest form of malaria, still causing around 450'000 deaths annually. During their asexual development within red blood cells P. falciparum parasites reside within a newly created compartment – the parasitophorous vacuole (PV), which is formed through an invagination of the red blood cell membrane during the invasion process. The PV is equipped with a number of parasite proteins to serve key functions in the interaction of the parasite with its host cell. However, only a limited number of the proteins of this compartment are known to date. In this work the BioID technique was used to systematically identify proteins of the PV compartment. BioID enables proximity-dependent biotinylation of compartment-specific proteins in living parasites based on the promiscuous biotin ligase BirA*. Affinity purification of the biotin-tagged proteins followed by mass spectrometry can then be used to identify the proteins tagged by BirA*. This approach resulted in the identification of 14 putative PV proteins of which 13 were further analysed using a GFP knock in strategy. This analysis revealed 7 novel PV proteins and 3 novel proteins with a partial PV localization. For 7 of the 10 newly identified PV proteins the exact location was determined: 3 were located at the outer face of the parasite plasma membrane and 4 at the inner face of the PV membrane. Surprisingly, no new proteins soluble in the PV space were identified. In order to screen the proteins for their essentiality regarding parasite survival, it was attempted to disrupt the corresponding genes using a strategy that permits the selection of such parasites. This approach was unsuccessful for 6 of the 10 identified PV proteins, indicating that they are likely essential for parasite growth. The identification of the novel PV proteins – especially the identification of likely essential ones – is an important step to further unravel the function of this parasite compartment. The attempt to further characterize protein function with a here generated knock side way system for the conditional inactivation of secretory proteins showed only limited success, precluding a systematic functional analysis of the candidates identified in this work using this technology. Therefore, the most promising candidate, PF3D7_1464600 (UIS2), was further analysed using the more time intensive diCre based conditional gene knock out system. UIS2 had previously been implicated in the regulation of translation through dephosphorylation of eIF2α-P in P. berghei liver stages. However, the here determined location of UIS2 in the PV renders such a function rather unlikely. DiCre based conditional gene knockout confirmed the essentiality of UIS2 for parasite growth. Parasites lacking UIS2 showed an arrest in ring stages. In addition, the lack of UIS2 caused an accumulation of the PVM resident protein ETRAMP2 and the Maurer’s cleft protein SBP1 within the parasite, indicating a defect in protein secretion or a general arrest of parasite functions immediately after invasion. Complementation of the UIS2 knockout cell line rescued the phenotype, while complementation with a catalytically dead mutant of the putative phosphatase domain did not. These results show that the phosphatase activity of UIS2 within the PV compartment is required for parasite survival and suggests a critical regulatory function of the dephosphorylation of proteins in this compartment for early parasite development. This work identified a series of new PV proteins of which one, a phosphatase previously identified as UIS2, was shown to hold a critical role for parasite development very early after invasion. Characterisation of the proteins of the PV will help to understand how the malaria parasite interacts with its host cell to exploit this unique niche to foster its own development.

Das Krankheitsbild der Malaria wird durch die asexuelle Replikation von Plasmodium spp. in den Erythrozyten verursacht. Unter den fünf human pathogenen Plasmodium Spezies ist P. falciparum für die schwerste Form der Malaria verantwortlich, welche jährlich rund 450'000 Todesopfer fordert. Die intraerythrozytäre Entwicklung des Parasiten findet in der parasitophoren Vakuole (PV) statt. Die PV wird während des Invasionsprozesses des Parasiten durch Invagination der Erythrozyten Membran neu gebildet und ist mit einer Vielzahl von Parasitenproteinen ausgestattet. Diese Proteine übernehmen Schlüsselfunktionen bei der Parasiten-Wirtszell-Interaktion, sind jedoch bisher zum größten Teil unbekannt. In dieser Arbeit wurde die BioID-Technik verwendet, um Proteine des PV-Kompartiments systematisch zu identifizieren. Durch die mutierte Biotin Ligase BirA* ermöglicht BioID die Biotinylierung nahegelegener, Kompartiment-spezifischer Proteine in lebenden Parasiten. Zur Identifizierung dieser biotinylierten Proteine wurden die Biotin-markierten Proteine zunächst aufgereinigt und anschließend mittels Massenspektrometrie untersucht. Dieser Ansatz führte zur Identifizierung von 14 putativen PV-Proteinen. 13 dieser Proteine wurden endogen mit GFP fusioniert und näher untersucht. Mittels Fluoreszenz-mikroskopie konnte die PV-Lokalisation für 10 Proteine bestätigt werden. Hiervon zeigten 3 Kandidaten nur eine partielle PV-Lokalisation. Für 7 der 10 neu identifizierten PV-Proteine konnte die exakte Position bestimmt werden: 3 Proteine befanden sich an der äußeren Seite der parasitären Plasmamembran und 4 Proteine an der Innenseite der PV-Membran. Widererwartend wurden keine neuen löslichen PV-Proteine identifiziert. Um die Proteine zusätzlich auf ihre Bedeutung für das Überleben des Parasiten zu untersuchen, wurden die entsprechenden Gene gezielt zerstört und jene Parasiten selektioniert, welche das zerstörte Gen beinhalteten. Dieser Ansatz war für 6 der 10 identifizierten PV-Proteine nicht erfolgreich. Dies lässt vermuten, dass die Proteine mit hoher Wahrscheinlichkeit essentiell für das Wachstum des Parasiten sind. Die Identifizierung der neuartigen PV-Proteine – insbesondere die Identifizierung von wahrscheinlich essentiellen Proteinen – ist ein wichtiger Schritt, um die Funktionen dieses Parasitenkompartiments weiter zu entschlüsseln. Der Versuch, die Proteinfunktion mit einem hier generierten System für die konditionelle Inaktivierung sekretorischer Proteine weiter zu charakterisieren, zeigte nur begrenzt Erfolg und schloss eine systematische funktionelle Analyse der in dieser Arbeit identifizierten Kandidaten mit dieser Methode aus. Daher wurde der vielversprechendste Kandidat, PF3D7_1464600 (UIS2), mit dem zeitintensiveren diCre-basierten konditionalen Gen-Knockout-System weiter analysiert. Zuvor wurde UIS2 mit der essentiellen Regulation der Translation durch Dephosphorylierung von eIF2α-P in P. berghei-Leberstadien in Zusammenhang gebracht. Die hier ermittelte Position von UIS2 in der PV stellt eine solche Funktion jedoch in Frage. Der diCre basierte konditionale Gen-Knockout bestätigte die essenzielle Eigenschaft von UIS2 für das Wachstum der Parasiten. Parasiten, denen UIS2 fehlte, zeigten einen Arrest in Ringstadien. Darüber hinaus führte der Verlust von UIS2 zu einer Akkumulation des PVM-Proteins ETRAMP2 sowie des Maurer’s Cleft-Proteins SBP1 innerhalb des Parasiten, was einen Defekt im Proteintransport oder einen allgemeinen Stillstand der Parasitenfunktionen unmittelbar nach der Invasion vermuten lässt. Die Komplementierung der UIS2-Knockout-Zelllinie konnte das Wachstum der Parasiten wiederherstellen. Im Gegensatz dazu war die Komplementierung mit einer katalytisch inaktivierten Mutante der putativen Phosphatasedomäne dazu nicht fähig. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Phosphataseaktivität von UIS2 innerhalb des PV-Kompartiments für das Überleben der Parasiten erforderlich ist. Dies legt eine kritische regulatorische Funktion der Dephosphorylierung von Proteinen in diesem Kompartiment für die beginnende Parasitenentwicklung nahe. In dieser Arbeit wurden eine Reihe neuer PV-Proteine identifiziert. Darunter eine Phosphatase, die zuvor als UIS2 beschrieben wurde. UIS2 zeigte eine wichtige Rolle in der frühen Parasitenentwicklung. Die weitere Charakterisierung der PV-Proteine wird das Verständnis erweitern, wie der Malariaparasit mit seiner Wirtszelle interagiert, um diese einzigartige Nische in der PV zu nutzen und somit seine eigene Entwicklung zu fördern.