Evaluierung der Bindungsaktivität und Stabilität des scFv 6H8 an die magenkarzinomspezifische Mutante E-Cadherin delta9

Abstract

Patienten im voranschreitenden Stadium einer Magenkrebserkrankung haben oftmals keine Therapiemöglichkeiten zur Bekämpfung des Tumors, werden meist lediglich hinsichtlich der Linderung ihrer Symptome behandelt. Die Anwendung bispezifischer Antikörper wäre bei Patienten mit einem diagnostizierten Magenkarzinom ein erfolgversprechender Therapieansatz. Bispezifische Antikörper sind in der Lage, immunkompetente und gleichzeitig maligne Zellen zu binden und gegen die gebundenen malignen Zellen zu aktivieren. Gegenwärtig konnte ein trifunktionaler monoklonaler Ratte-Maus-Hybridantikörper (Removab®, Catumaxomab) in der EU zugelassen werden. Weitere Produkte befinden sich in der klinischen Prüfung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bindungsaktivität von Antikörperfragmenten gegen eine magenkarzinomspezifische Mutante des E-Cadherin, das E-Cadherin∆9 und gegen EpCAM evaluiert. Das E-Cadherin-∆9-spezifische scFv 6H8 wurde durch die Firma Geneart® in Regensburg synthetisiert, anschließend in dem in dieser Arbeit konstruierten Expressionsvektor PAK400scFv6H8 eingebaut und durch periplasmatische Expression in E. coli produziert. Eine wesentliche Charakterisierung des scFv 6H8 konnte mittels Western Blot gegen die per Gateway® Cloning Technology hergestellte Mutante des E-Cadherin∆9 nachgewiesen werden, welche eine zufriedenstellende Bindungsaktivität und Spezifität hervorbrachte bzw. aufwies. Als zweites Target wurde zudem das in Tumorzellen generell stark exprimierte EpCAM ausgewählt. Ein EpCAM-spezifisches scFv wurde durch die Firma Geneart® in Regensburg synthetisiert, in dieser Arbeit in den Expressionsvektor PAK400scFvEpCAM eingebaut und durch periplasmatische Expression in E. coli produziert. Die Stabilität des EpCAM scFvs wurde getestet und die Bindung an Krebszellen mittels Immunhistochemie erfolgreich nachgewiesen. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit wurde möglicherweise die Grundlage gelegt, nach einem Einbau der spezifischen Antikörperfragmente in einen Triplebody, einen neuen Therapieansatz für die Behandlung des Magenkarzinoms im fortgeschrittenen Stadium zu entwickeln.

Gemnerally, patients in the advancing stage of gastric cancer have no or limited curative therapy options, and are usually treated only to alleviate their symptoms. The use of bispecific antibodies would be a promising therapeutic approach for patients diagnosed with gastric carcinoma. Bispecific antibodies are able to redirect and activate immunocompetent cells to the malignant cells. Currently, a trifunctional monoclonal rat-mouse hybrid antibody (Removab®, Catumaxomab) has been approved in the EU (however, approval has been withdrawn for economic reasons). Further products are in clinical trials. The present dissertation evaluated the binding activity of antibody fragments against a gastric carcinoma-specific mutant of E-cadherin, E-Cadherin∆9 and against EpCAM. The E-cadherin-∆9-specific scFv 6H8 was synthesized by Geneart® in Regensburg, subsequently incorporated into the expression vector PAK400scFv6H8 constructed in this dissertation and produced by periplasmic expression in E. coli. An essential characterization of scFv 6H8 could be demonstrated by Western blot against the E-Cadherin∆9 mutant produced by Gateway® Cloning Technology, which produced or demonstrated satisfactory binding activity and specificity. The second target was EpCAM, which is generally highly expressed in tumor cells. An EpCAM-specific scFv was synthesized by Geneart® in Regensburg, incorporated in this dissertation into the expression vector PAK400scFvEpCAM and produced by periplasmatic expression in E. coli. The stability of the EpCAM scFvs was tested and the binding to cancer cells was successfully demonstrated by immunohistochemistry. The results of this work may have laid the basis for developing a new therapeutic approach for the treatment of gastric carcinoma in the advanced stage after incorporation of the specific antibody fragments into a triplebody.