Auswirkungen von Perfluorbutylpentan (F4H5) auf corneale Endothelzellen im porcinen Hornhautmodell

Abstract

Silikonöl wird im Rahmen der Pars-Plana-Vitrektomie (PPV) zur Glaskörpertamponade verwendet. Im Verlauf kann es hierbei zur Emulsifikation des Silikonöls zu kleinen Silikonöltröpfchen oder zur Entstehung von „sticky silicone oil“ kommen. Emulsifiziertes Silikonöl kann Ursache eines Sekundärglaukoms sein. „Sticky silicone oil“ tendiert aufgrund seiner Konsistenz und chemischen Eigenschaften dazu, an Intraokularlinsen oder der Netzhaut zu haften, was zu Sehbeeinträchtigungen führen oder gar während operativen Eingriffen die Einsicht von vitreoretinalen Chirurgen erschweren kann. Mechanische Verfahren zur Entfernung von „sticky silicone oil“ erwiesen sich als unzureichend, sodass oft nur der Austausch der betroffenen Intraokularlinse als Lösung verblieb. Auch emulsifiziertes Silikonöl kann zu Visusbeeinträchtigungen führen und unter Umständen gleichermaßen nicht einfach zu entfernen sein. Als amphiphile Substanz zeigte Perfluorbutylpentan (F4H5) - ein semifluoriertes Alkan (SFA) - in mehreren Studien vielversprechende Ergebnisse bei der Entfernung von „sticky silicone oil“ und emulsifiziertem Silikonöl aus dem Auge. Anderen SFAs wurde jedoch in verschiedenen Studien eine teils erhebliche Toxizität nachgewiesen. Da eine Biokompatibilitätstestung von F4H5 bezüglich der Verträglichkeit mit dem Hornhautendothel bisher ausstehend ist, kann F4H5 im vorderen Augenabschnitt bisher nur im Rahmen eines off-label-use verwendet werden. Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung der Auswirkungen von Perfluorbutylpentan (F4H5) auf corneale Endothelzellen in einem organo-typisch kultivierten porcinen Hornhautmodell („split corneal buttons“). Nach Resektion eines Teils des Hornhaut-Epithels und des -Stromas erfolgte die Inkubation in F4H5 (15, 30, 60, 120 min) bzw. in balanced salt solution (BSS, Kontrollen). An Tag 1, 8 und 15 wurde die Endothelzelldichte (ECD) quantifiziert. Zusätzlich erfolgte eine Analyse morphologischer Veränderungen der Endothelzellen (Reformationsfiguren, Rosettenformationen, Alizarin-rote Areale). Nur nach Inkubation der „split corneal buttons“ in F4H5 für 120 min zeigte sich erst an Tag 15 eine signifikant höhere Abnahme der ECD im Vergleich zur Kontrollgruppe (Median ± 25%/75%-Quartil; control 3658 ± 129/296 Zellen/mm²; F4H5 120min 3281 ± 43/222 Zellen/mm²; p = 0.046). Kürzere Inkubationszeiten (15, 30, 60 min) hatten keinen signifikanten Einfluss auf die ECD. Die erhobenen morphologischen Parameter unterstützen diese Beobachtung mit einer im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhten Prävalenz von Reformationsfiguren (F4H5 120min: 10.5 ± 9.3/13.9 % vs. control: 5.2 ± 2.8/7.2 %; p = 0.010), Rosettenformationen (F4H5 120min 25.566 ± 17.044/36.219/mm² vs. control: 8.333 ± 0.000/15.667/mm²; p = 0.002) und Alizarin-roter Areale (F4H5 120min: 38.350 ± 29.827/51.333/mm² vs. control: 20.833 ± 10.417/25.000/mm²; p = 0.049) nach 120-minütiger Inkubation in F4H5. In der Gruppe F4H5 60min zeigten sich ebenfalls vermehrt Rosettenformationen (25.452 ± 16.968/36.057/mm²; p = 0.006) und Alizarin-rote Areale (46.662 ± 42.420/50.903/mm²; p = 0.007), jedoch kein signifikant höherer Anteil an Reformationsfiguren (7.0 ± 2.2/1.6 %; p = 0.953). Keinerlei signifikante Auffälligkeiten zeigten sich an Tag 8. Demnach geben die Ergebnisse keine Hinweise auf negative Effekte von F4H5 nach einer Inkubation für 15 und 30 min. Nach 60 min besteht allerdings ein fraglicher Schaden. Allein die Inkubation für 120 min zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe klare Hinweise auf einen schädigenden Einfluss von F4H5. Ob F4H5 direkte oder indirekte Einflüsse auf das Hornhautendothel besitzt kann mit dem verwendeten Versuchsmodell nicht beantwortet werden. Um die zugrundeliegenden Mechanismen genauer zu evaluieren sind weitere Untersuchungen notwendig. Die kurzzeitige Verwendung von F4H5 zur Entfernung von „sticky silicone oil“ oder emulsifizertem Silikonöl, wie sie in der Praxis üblich ist, scheint keine negativen Effekte auf das Hornhautendothel zu haben. Dennoch sollte eine ausreichende Entfernung von F4H5 aus dem Auge durch mehrfache Spülung, beispielsweise mit BSS, erfolgen. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden in einem direkten Vergleich der Auszählungsmethoden quantitative Unterschiede zwischen der Auswertung der ECD ohne Färbung in hypotoner BSS-Lösung mit der Analyse nach Färbung in Trypanblau und Alizarinrot S evaluiert. Hierbei zeigten sich keine signifikanten Unterschiede der ECD, sodass eine Verlaufsbeurteilung in hypotoner BSS-Lösung als valide Beurteilungsmethode angesehen werden kann.

Silicone oil is commonly used in pars-plana-vitrectomy (PPV) as vitreous tamponade. A complication of the use of silicone oil is the formation of “sticky silicone oil” and the emulsification of silicone oil to small silicon oil bubbles. “Sticky silicone oil” may adhere to intraocular lenses or the retina and consequently cause visual impairments or the disturb the intraoperative view of vitreoretinal surgeons. As mechanical procedures usually do not allow sufficient removal of “sticky silicone” oil” and additional damage may be caused, often the exchange of the intraocular lens is the only possible treatment. Also, emulsified silicone oil can have a negative impact on visual acuity or possibly cause secondary glaucoma. The amphiphilic substance perfluorobutylpentane (F4H5), a semifluorinated alkane (SFA), showed promising features as a solving agent removing emulsified silicone oil or “sticky silicone oil” from intraocular lenses or the retina in a feasible and fast wash out procedure, which makes other more invasive or ineffective interventions increasingly obsolete. Several studies provided clear evidence for the toxicity of various SFAs. However, as biocompatibility tests of F4H5 have yet to be conducted, F4H5 may only be used off-label within the anterior eye chamber. This study used an organo-typically cultivated porcine corneal organ culture model (“split corneal buttons”) to investigate the effects of F4H5 on the corneal endothelium. After removal of the epithelium and parts of the corneal stroma, “split corneal buttons” were incubated in F4H5 for 15, 30, 60 and 120 min or balanced salt solution (BSS, controls). Endothelial cell density (ECD) was assessed on day 1, 8 and 15. Additionally, morphological characteristics (reformation figures, rosette formations, alizarin red areas) were assessed on day 15 as indirect markers of cell destruction and rearrangement processes. Only the incubation in F4H5 for 120 min caused significant higher endothelial cell losses until day 15 compared to the control group (median ± 25%/75%-quartiles; control 3658 ± 129/296 cells/mm²; F4H5 120min 3281 ± 43/222 cells/mm²; p = 0.046). Shorter incubation times (15, 30, 60 min) did not have a significant influence on ECD. Morphological parameters support these findings as there was a significantly higher prevalence of reformation figures (F4H5 120min: 10.5 ± 9.3/13.9 % vs. controls: 5.2 ± 2.8/7.2 %; p = 0.010), rosette formations (F4H5 120min 25.566 ± 17.044/36.219/mm² vs. controls: 8.333 ± 0.000/15.667/mm²; p = 0.002) and alizarin red cells (F4H5 120min: 38.350 ± 29.827/51.333/mm² vs. controls: 20.833 ± 10.417/25.000/mm²; p = 0.049) after incubation in F4H5 for 120 min. Also, the group F4H5 60 min showed significantly more rosette formations (25.452 ± 16.968/36.057/mm²; p = 0.006) and alizarin red cells (46.662 ± 42.420/50.903/mm²; p = 0.007), but not reformation figures (7.0 ± 2.2/1.6 %; p = 0.953). On day 1 and 8 none of the groups showed significant differences compared to the control group. The conducted experiments showed no adverse effects of F4H5 on the corneal endothelial cell density after shorter incubation times in F4H5 (15, 30 minutes). Questionable damage may be found after 60 minutes. Solely, the incubation time of 120min in F4H5 resulted in significantly higher endothelial cell losses and a higher prevalence of the assessed morphological parameters when compared to controls. For this reason, complete removal of F4H5 from the eye, for example using BSS, at the end of the wash-out-procedure is recommended. It remains unclear whether F4H5 has direct or indirect impact on the corneal endothelium. The used research model gives no answers regarding underlying mechanisms of the observed damaging effects after longer incubation times in F4H5. However, short exposure to F4H5 seems to be safe Furthermore, a direct comparison between the unstained analysis of endothelial cell density (hypotonic balanced salt solution, hBSS) and stained ECD analysis with trypan blue and alizarin red S was performed. proved the accuracy and validity of unstained ECD counting results. No significant differences in ECD were detected within both groups. Thus, ECD analysis using hBSS is a valid method to perform cell counts multiple times throughout the course of experiments.