Charakterisierung des Inneren Membrankomplexes in P. falciparum (Welch, 1897)

Abstract

Malaria stellt für viele Länder der Welt eine ernste Gesundheitsbedrohung dar. Diese Infektionskrankheit wird durch einzellige Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht, die von Anopheles-Mücken auf den Menschen übertragen werden. Als direkte Folge der Infektion mit dem tödlichsten Malariaerreger Plasmodium falciparum sterben jährlich 435000 Menschen, insbesondere Kinder unter fünf Jahren. Bis heute steht kein effektiver Impfstoff zur Verfügung und weltweit treten Resistenzen gegen alle geläufigen Substanzen zur Malariabekämpfung auf. Alle Symptome der Malariaerkrankung resultieren aus der exponentiellen, asexuellen Vermehrung des Parasiten im Blut. Unter anderem während dieser Blutphase der Infektion kommt dem Inneren Membrankomplex (IMC) eine herausragende Rolle während der Invasion in die roten Blutzellen, der Segregation der Tochtermerozoiten und der Gametozytogenese zu. Der IMC besteht aus einer mit dem Zytoskelett assoziierten Doppelmembranstruktur unterhalb der Plasmamembran der Merozoiten. Dieses zelluläre Alleinstellungsmerkmal findet man lediglich bei Einzellern des phylogenetischen Stammes der Alveolata, zu denen neben den Apikomplexa auch die Dinoflagellata und Ciliophora zählen. In Plasmodien sind ca. 35 IMC-Proteine identifiziert und z. T. charakterisiert. Einige spezifische Proteine definieren hierbei einen distinkten Bereich innerhalb des IMC – den Basalkomplex. Diese dynamische Ringstruktur ist essentiell für die Biogenese der Tochterzellen. Die Bedeutung dieser Struktur steht allerdings im klaren Gegensatz zur begrenzten Kenntnis die wir über sie besitzen. Zur Identifizierung neuer Basalkomplex-Proteine wurde eine induzierbare proximity-dependent biotin identification-Methode (DIQ-BioID) angewendet. Hierbei vermittelt ein FKBP-FRB-Heterodimerisierungsystem die Lokalisation der Ligase BirA* am Basalkomplex-Markerprotein Morn1 und ermöglich damit die Biotinylierung benachbarter Interaktionspartner, die dann aufgereinigt und mit Hilfe der Massenspektrometrie bestimmt wurden. Dabei wurden als potentielle Basalkomplex-Kandidaten ein bislang uncharakterisiertes Protein (PF3D7_1019100), eine HAD-Protein (PF3D7_1118400), MyoJ sowie u. a. Vertreter der Kinesin-Familie identifiziert. Im Anschluss wurden fünf Vertreter der Kinesine in P. falciparum charakterisiert. Kolokalisations-Studien zeigen, dass die Kinesine 5 und 8.2 im Mikrotubuli-organisierendem Zentrum (MTOC) lokalisieren. Mislokalisation der individuellen Kinesine in den Kern, bzw. an die Plasmamembran hat keinen Einfluss auf die Proliferation der Parasiten bzw. auf die Ausbildung des IMC. Dies deutet auf ihre redundante Funktion unter den gewählten Versuchsbedingungen hin. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Analyse des Abbaus des IMC nach erfolgreicher Invasion in die rote Blutzelle initiiert. Hierbei ergab eine proteinbiochemische Analyse, dass der Abbau der IMC-Proteine wahrscheinlich über das Ubiquitin-Proteasom-System erfolgt. Die Visualisierung der GFP-markierten IMC-Proteine in vivo nach Zusammenbruch der Doppelmembran, zeigt eine unterschiedliche Lokalisation der Proteine, bzw. Proteinfragmente abhängig von ihrem Membranassoziationsmechanismus im IMC. Hochauflösende FIB-SEM-Mikroskopie zur Darstellung der IMC-Membranen in 3D verdeutlicht, dass der IMC innerhalb von weniger als 15 Minuten nach erfolgreicher Invasion in die rote Blutzelle nicht mehr unter der Plasmamembran nachweisbar ist und sich der Abbau in P. falciparum grundlegend vom Abbau des IMC in verwandten Organismen unterscheidet.