Entwicklung eines molekularbiologischen Testsystems zum Nachweis von Inhibitoren bakterieller Topoisomerasen, deren Wirkung und des DNA-Superspiralisierungsgrades in vivo

Abstract

Zusammenfassung: Topoisomerase I und Gyrase kontrollieren in Bakterienzellen die DNA-Superspiralisierung. Aufgrund der essentiellen Funktion und der ubiquitären Verbreitung von Gyrase haben hoch wirksame Inhibitoren, wie Fluorchinolone, eine große Bedeutung als Antibiotika mit breitem Indikationsgebiet erlangt. Die zunehmende Resistenzentwicklung auch gegen diese synthetische Antibiotikaklasse schränkt jedoch ihre Anwendeung mehr und mehr ein. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von molekularbiologischen Nachweisverfahren, mit denen die Ermittlung neuer Inhibitoren von Gyrase und Topoisomerase I über eine Detektion der Veränderungen im Superspiralisierungsgrad in vivo möglich ist. Damit unterscheidet sich das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Testsystem von allen bisher für die Untersuchung der Superspiralisierung in Bakterienzellen angewandten In-vitro-Verfahren durch einfache und rasche Durchführung, hohe Empfindlichkeit und exakte Bestimmung des Superspiralisierungsgrades. Die Bestimmung des DNA-Superspiralisierungsgrades in vivo erfolgte mit drei verschiedenen Reportergenplasmidpaaren, die das Reportergen luc unter der Kontrolle eines vom Superspiralisierungsgrad jeweils reziprok abhängigen Promotors (ptopA oder pgyrA) tragen. Mit diesem Testsystem ließen sich Veränderungen des Superspiralisierungsgrades aufgrund unterschiedlicher Einflüsse, wie (I) die spezifische Inhibition der Gyrase (durch Fluorchinolone und Aminocumarine) (II) die durch Mutationen hervorgerufenen Beeinträchtigungen der Enzymaktivitäten von Topoisomerase I und Gyrase (III) die auf äußere Faktoren, wie Interkalation von Ethidiumbromid, Änderung der Osmolarität oder des Nährstoffangebots zurückzuführenden Veränderungen der DNA-Superspiralisierung, detektieren. Das Testsystem bietet die Möglichkeit potentielle alternative Hemmstoffe von Gyrase und Topoisomerase I sowie interkalierende Hemmstoffe zu identifizieren. Darüber hinaus erlauben die Messdaten eine Quantifizierung der Wirkung von Fluorchinolonen und Aminocumarinen auf molekularer Ebene. Das Testverfahren wurde im Naturstoffscreening sowohl von Kulturüberständen als auch von Extrakten und Reinsubstanzen eingesetzt. Durch die Verwendung der hyperempfindlichen E. coli TolC-Mutante DE112 konnte die Sensitivität des Testsystems gesteigert werden. Für einen Einsatz als Screeningverfahren mit erhöhtem Probendurchsatz ist das Testsystem erfolgreich für die Bestimmung des Superspiralisierungsgrades in Mikrotiterplattenformat eingesetzt worden und bietet sich damit besonders für ein Wirkstoffscreening an.

Summary: Control of DNA supercoiling is carried out by topoisomerase I and gyrase in bacterial cells. Due to its essential function and ubiquitous distribution, gyrase is target structure of the highly effective antibacterial fluoroquinolones. However, increasing development of resistance to these synthetical antibiotics restricts their application against infectious diseases. Aim of this work was the development of a molecularbiological assay, which allows the discovery of novel antibiotics targeting topoisomerase I and gyrase by detection of changes in supercoiling in vivo. In contrast to existing assays, the system presented here offers high sensitivity and accuracy as well as facile and rapid handling. Determination of the DNA supercoiling degree in vivo was carried out using three different pairs of reporter gene plasmids, containing the promoter of either topoisomerase I (ptopA) or gyrase (pgyrA) transcriptionally fused to the reporter gene luc. Alterations in the supercoiling degree due to various effects, such as specific inhibition of gyrase, mutations in topoisomerase I and gyrase genes as well as external factors like nutrition supply, were detectable by using the developed assay. The test system offers the opportunity to identify new and potential specific inhibitors of topoisomerase I and gyrase as well as structural inhibitors like DNA-intercalating agents. Additionally, quantification of the impact of fluoroquinolones and aminocumarins is possible. The assay has been used for screening of supernatants of bacterial cultures, herbal extracts and various isolated substances. By applying the hypersensitive E. coli tolC-mutant DE112 sensivity of the system was increased significantly. Determination of the supercoiling degree was successfully carried out in microtiter plates, which establishes the opportunity of high sample throughput