The immunoregulatory role of T cell-derived CD73 in the context of inflammation

Abstract

Die Fähigkeit zur Selbstregulierung ist für das Immunsystem von zentraler Bedeutung, um Immunreaktionen zu kontrollieren und somit übermäßige Schädigungen am umliegenden Gewebe zu verhindern. Die Immunantwort wird unter anderem durch purinerge Signalmoleküle, insbesondere ATP und Adenosin, gesteuert. Im Verlauf einer Entzündung setzen aktivierte Immunzellen ATP in den extrazellulären Raum frei, wo es entzündungs-fördernd wirkt. Durch das Ekto-Enzym CD39 wird ATP zu AMP, dem Substrat der Ekto-Nukleotidase CD73, abgebaut. Die enzymatische Aktivität von CD73 führt zur Bildung von Adenosin, welches die Immunantwort unterdrückt und somit einen entzündungshemmenden Effekt hat. Aufgrund dieser enzymatischen Aktivität ist es naheliegend, dass CD73 eine entscheidende Funktion bei der Regulation von T-Zellantworten hat. Das Ziel dieser Dissertation ist, die immunregulatorische Rolle des von T-Zellen stammenden CD73 im Zusammenhang mit Entzündungen zu untersuchen. Im humanen T-Zellkompartiment wird CD73 von den meisten naiven CD8 T-Zellen, einem kleinen Teil der CD4 Gedächtnis-T-Zellen und sehr wenigen regulatorischen T-Zellen exprimiert. Sowohl CD8 als auch CD4 T-Zellen verlieren CD73 nach Aktivierung von der Plasmamembran. Allerdings wurden Aktivierung und Proliferation der T-Zellen weder durch die künstliche Entfernung von CD73 von der Zelloberfläche noch durch die Inhibition der enzymatischen Aktivität beeinflusst. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der Verlust der CD73-Oberflächenexpression nicht die T-Zellaktivierung auslöst, sondern möglicherweise vor allem dazu dient, die aktivierte Effektor-T-Zelle vor Adenosin-vermittelter Suppression zu schützen. Der Verlust der CD73-Oberflächenexpression geht mit einem Anstieg der AMPase-Aktivität in Zellkulturüberständen aktivierter T-Zellen einher. Die Analysen ergaben, dass CD73 mit Vesikelmarkern in aktivierten CD8 T-Zellen ko-lokalisiert und in extrazellulären Vesikeln (EVs) freigesetzt wird. Diese von aktivierten Effektor-T-Zellen freigesetzten EVs vermitteln den größten Teil der AMPase-Aktivität in T-Zellkulturüber-ständen. Nach erfolgreicher Etablierung eines in-vitro-Tests zur Messung des immun-regulatorischen Potenzials dieser EVs zeigte sich, dass diese die erforderliche AMPase-Aktivität besitzen, um Effektor-T-Zellen über den purinergen Signalweg zu inhibieren. Darüber hinaus kooperieren EVs von CD8 T-Zellen mit regulatorischen T-Zellen, die aufgrund ihrer geringen CD73-Oberflächenexpression auf eine exogene AMPase-Quelle angewiesen sind, um die Adenosin-vermittelte Suppression von T-Zellen auszuführen. Zudem weisen EVs, die aus der Synovialflüssigkeit entzündeter Gelenke isoliert wurden, eine CD73-spezifische AMPase-Aktivität auf und können unter Bedingungen, die die purinergen Signalwege begünstigen, eine immunsuppressive Funktion erlangen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass aktivierte humane CD8 T-Zellen CD73+ EVs mit immunsuppressiver Funktion freisetzen. Aus den Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass die durch CD73 vermittelte Adenosinproduktion von Effektor-T-Zell-EVs einen intrinsischen Mechanismus der Immunsuppression beim Menschen darstellt.

The ability of self-regulation is central for the immune system to terminate immune responses and to prevent excessive collateral tissue damage. Purinergic signaling controls effector and regulatory responses of the immune system, mainly through ATP and adenosine. Upon inflammation, immune cells release ATP into the extracellular space, where it acts as pro-inflammatory molecule. Degradation of ATP by the ecto-enzyme CD39 yields AMP, the substrate for the ecto-nucleotidase CD73. The enzymatic activity of CD73 leads to the generation of adenosine, a potent suppressor of effector T cells, indicating a crucial function for CD73 in the regulation of T cell responses. The aim of my thesis is to elucidate the immunoregulatory role of T cell-derived CD73 in the context of inflammation. Most naïve CD8 T cells, a small proportion of memory CD4 T cells and very few regulatory T cells express CD73 in the human T cell compartment. We found that CD8 and CD4 T cells lose CD73 from the plasma membrane after activation. Neither artificial removal of CD73, nor blockade of its enzymatic activity affects activation or proliferation kinetics. We therefore concluded that loss of CD73 surface expression does not actively trigger T cell activation, but it is a consequence of it, possibly to protect effector T cells from adenosine-mediated suppression. Concomitant with the loss of surface CD73 expression, we measured increased AMPase activity in cell culture supernatants of activated T cells. We observed that CD73 co-localizes with vesicle markers in activated CD8 T cells, and showed that extracellular vesicles (EVs) released from activated effector T cells contain CD73 and mediate most of the AMPase activity in T cell culture supernatants. We successfully established an in vitro assay to measure the immunoregulatory potential of these EVs, and found that they provide the necessary AMPase activity to suppress effector T cells through the purinergic pathway. Moreover, CD8 T cell-derived EVs cooperate with regulatory T cells, which, due to low CD73 expression, depend on an exogenous source of AMPase activity to induce adenosine-mediated T cell suppression. We further showed that EVs from the synovial fluid of inflamed joints possess CD73-specific AMPase activity and can acquire immunosuppressive function under conditions that favor adenosine signaling. In conclusion, I showed in this thesis that activated human CD8 T cells release CD73+ EVs with immunosuppressive function. We propose that CD73-mediated adenosine production by effector T cell-derived EVs constitutes an intrinsic mechanism of immune suppression in humans.