Modulation von Kv4.2-Kanälen durch ein Peptidtoxin isoliert aus dem Gift der Vogelspinne Theraphosa leblondi

Abstract

Spannungsaktivierte Kaliumkanäle spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Membranspannung erregbarer Zellen. Der durch diese Ionenkanäle vermittelte Stromfluss kann durch Peptide, welche aus dem Gift von Tieren isoliert wurden, inhibiert werden. Einige der aus Spinnengiften isolierten Peptide zeigen dabei eine besonders hohe Affinität für die Subfamilie der Kv4-Kanäle. In dieser Arbeit wurde die Wirkung des Giftes der Vogelspinne Theraphosa leblondi und eines daraus isolierten Peptids auf spannungsaktivierte Kaliumkanäle und im Besonderen auf den Kv4.2-Kanal untersucht. Dazu wurden zunächst in Neuronen vorkommende K+-Ströme und dann Ströme durch transient in embryonalen Nierenzellen (HEK 293) exprimierte Kv-Kanäle mit der Patch-Clamp-Technik in der Whole-Cell-Konfiguration gemessen. Die Applikation des Giftes bewirkte ein selektive Inhibierung der neuronalen A-Typ-Strom-Komponente. Aus dem Gift wurden in einem weiteren Schritt drei Peptide isoliert (TlTx1, TlTx2 und TlTx3). Für eines dieser Peptide (TlTx1) konnte eine Wirkung auf den Kv4.2-Kanal nachgewiesen werden. In weiteren elektrophysiologischen Experimenten wurde die Wirkung von TlTx1 auf durch den Kv4.2-Kanal vermittelte Ströme genauer charakterisiert. Es zeigte sich, dass die Applikation des Toxins einVeränderung der spannungsabhängigen Aktivierung, der Deaktivierung und außerdem der Inaktivierung des Kanals bewirkt. Die Veränderungen von Aktivierung und Inaktivierung konnten in ähnlicher, wenn auch quantitativ abweichender Form, bereits während Applikation des Giftes beobachtet werden. Durch Konstruktion einer Chimäre aus dem für TlTx1 insensitiven Kv2.1-Kanal und dem TlTx1-sensitiven Kv4.2-Kanal konnte gezeigt werden, dass bei der Bindung des Toxins an den Kv4.2-Kanal die Linkerregion zwischen den Segmenten 3 und 4 (S3-S4) des Kanals eine wichtige Rolle spielt. Die Wirkung von TlTx1 auf die Gating-Parameter und dort insbesondere auf die Deaktivierungskinetik des Kv4.2-Kanals zusammen mit den Ergebnissen aus den Chimärenexperimenten führten zu der Schlussfolgerung, dass es sich bei TlTx1 um ein gating-modifizierendes Peptid handelt.

In order to find new peptide inhibitors for voltage-dependent potassium (Kv) channels, we examined the effects of venom from Theraphosa leblondi on Kv channel-mediated currents with the whole-cell patch-clamp technique. Both A-type currents in cultured hippocampal neurons and A-type currents recorded from HEK 293 cells transiently expressing recombinant Kv4.2 channels were selectively inhibited by T. leblondi venom. No venom activity was observed on recombinant Kv1.3, Kv1.4, Kv2.1 or Kv3.4 channels. We purified and sequenced three novel homologous peptides from this venom, which are related to previously identified Kv4 channel-specific peptide inhibitors and were named T. leblondi toxin (TLTx) 1, 2 and 3. The mode of action of TLTx1 on recombinant Kv4.2 channels was studied in more detail. TLTx1 inhibited Kv4.2-mediated currents with an IC50 of 200 nM, and macroscopic current inactivation was slowed in the presence of TLTx1. Notably, TLTx1 also caused a shallower voltage dependence of Kv4.2 peak conductance and a shift of the activation midpoint to more positive potentials. TLTx1 caused a noticable slowing of Kv4.2 activation kinetics, and Kv4.2 deactivation kinetics were accelerated by TLTx1 as infered from Rb tail current measurements. Chimeric Kv2.1(4.2L3-4) channels, in which the linker region between S3 and S4 of the TLTx1-insensitive Kv2.1 channel was replaced by the corresponding Kv4.2 domain, were sensitive to TLTx1. Apparently, TLTx1 can act as a gating modifier of Kv4.2 channels.