A Temporal Analysis of Host Chromatin Changes and Transcriptional Responses Induced by Latent Kaposi’s Sarcoma associated Herpesvirus Infection

Abstract

The human ɣ-herpesvirus Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is associated with several cancers, including Kaposi Sarcoma, a tumor of endothelial origin as well as the two B cell malignancies Primary Effusion Lymphoma and Multicentric Castleman’s Disease. Like other herpesviruses, KSHV can establish a latent state of infection, which allows life-long persistence in its host. Previous studies revealed that latent KSHV infection does not only lead to the acquisition of epigenetic modifications on the viral genome but might also induce re-localization of epigenetic host factors. Additionally, there is evidence from more recent data that KSHV infected cells undergo epigenetic changes at distinct host loci which might play a role during tumorigenesis. However, a detailed and, more importantly, a temporal genome wide analysis of host epigenetic changes upon KSHV infection in a relevant in vitro system is still missing. Thus, the aim of this study was to investigate KSHV-induced epigenetic short- and long-term consequences with the help of an efficient latent infection system in endothelial cells. ChIP-seq, MeDIP-seq and RNA-seq were performed to monitor histone modification and DNA methylation changes, as well as associated alterations of transcription patterns at various time points post infection. Despite the moderate transcriptomic deregulation observed during KSHV infection, a distinct interferon response signature persisted for several weeks in strictly latent cultures. Single cell RNA-seq furthermore suggests that these signatures originated from a small subset of cells, which show no evidence of lytic reactivation. While interferon regulated genes were not affected by histone modification changes due to a potential epigenetic pre-activation, several other regions were identified that undergo significant epigenetic remodeling. Remodeling was observed for activating as well as repressive histone modifications, with the most evident changes occurring at the level of acetylated histone H3 lysine 27 (H3K27ac), which is a mark for active genes as well as enhancer regions. Multiple altered regions mapped to genes which exhibited mild but detectable transcriptional deregulation. However, remodeled regions were also detected which are not directly linked to differentially expressed genes, indicating a potential predisposition which might only lead to phenotypic manifestation upon the presence of additional stimuli. Comparison of KSHV infected and cleared cells allowed for the investigation of such predisposed regions. A subset of histone modification changes remained stable in the cleared population although the transcriptional profile of these cells was almost completely reconstituted to the initial uninfected state. Challenging these cells with different stimuli, like KSHV re-infection led to a more pronounced transcriptional response of at least some of the predisposed regions. Based on these findings, we suspect that KSHV actively modulates epigenetic pathways, which might affect the viral life cycle, but also lead to alterations of the host epigenome. Beside KSHV dependent chromatin changes, a subset of deregulated regions might become independent of the infection as indicated by stable changes in KSHV cleared cells. As it is thought that virus-mediated tumorigenesis is a long-term consequence of latent infection, these distinct epigenetic states, potentially together with other stimuli, may promote KSHV mediated tumorigenesis.

Das ɣ-Herpesvirus Kaposi Sarkom-assoziiertes Herpesvirus (KSHV) ist ein humanpathogenes Virus, welches mit der Entstehung zahlreicher Tumore assoziiert ist. Dazu zählt zum einen das Kaposi Sarkom, ein Tumor endothelialen Ursprungs, sowie die beiden B Zell Tumore Primäres Effusionslymphom und die multizentrische Castleman Erkrankung. Wie auch andere Herpesviren kann KSHV einen latenten Infektionsstatus einnehmen, der es ihm erlaubt lebenslang im Wirt zu persistieren. Während dieses latenten Lebenszyklus erhält das virale Genom nicht nur epigenetische Modifikationen, um große Teile seines Genoms transkriptionell still zu legen. KSHV scheint auch in der Lage zu sein, epigenetische Faktoren gezielt zu manipulieren, um den Aufbau der epigenetischen Modifikationen auf dem viralen Genom zu fördern. Neuere Erkenntnisse deuten ebenfalls darauf hin, dass KSHV infizierte Zellen epigenetische Veränderungen in spezifischen Wirtsregionen aufweisen, die eine Rolle bei der Virus-induzierten Tumorentstehung spielen könnten. Allerdings wurde bezüglich dieser veränderten Regionen bisher keine detaillierte und zeitlich aufgelöste Genom-weite Studie in einem relevanten in vitro System durchgeführt. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, ein latentes KSHV Infektionssystem in Endothelzellen zu etablieren, womit die Analyse von KSHV induzierten Kurz-und Langzeitfolgen auf dem Wirtsepigenom ermöglicht wurde. ChIP-seq, MeDIP-seq und RNA-seq wurden durchgeführt, um Veränderungen von Histonmodifikationen und DNA-Methylierung zu detektieren und diese auch mit transkriptionellen Mustern zu korrelieren. Obwohl lediglich geringe transkriptionelle Veränderungen während einer KSHV Infektion festgestellt wurden, war dennoch eine deutliche Interferon Antwort in latent infizierten Zellen erkennbar, die sich über einen unerwartet langen Zeitraum erstreckte. Mithilfe von Einzel-Zell Sequenzierung konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass lediglich einzelne Zellen für diese späte Immunantwort verantwortlich sind, die allerdings keinerlei Zeichen einer lytischen Reaktivierung von KSHV aufwiesen. Während für Interferon-induzierte Gene kaum Veränderungen auf Histonmodifikationsebene festgestellt werden konnten, womöglich aufgrund eines epigenetisch prä-aktivierten Zustands, wurden zahlreiche andere Regionen mit differentiellen epigenetischen Mustern identifiziert. Veränderungen konnten sowohl für aktivierende also auch für reprimierende Modifikationen detektiert werden, jedoch zeigten sich die am auffälligsten veränderten Regionen fast immer auf der Ebene von H3K27ac, eine Modifikation, die charakteristisch für Enhancer-Bereiche ist. Während zahlreiche dieser differentiellen Bereiche auch leichte, aber detektierbare Veränderungen bezüglich der Transkription aufwiesen, gab es auch einige Regionen, die nicht direkt mit einer transkriptionellen Antwort einhergingen. Deshalb wurde vermutet, dass solche Regionen einer Prädisposition unterzogen werden, die lediglich durch einen sekundären Stimulus zu einer phänotypischen Ausprägung führt. Um diese Hypothese zu untersuchen wurden KSHV infizierte Zellen mit einer parallel kultivierten Population verglichen, die eine Infektion erfolgreich überwinden konnte. Dies ermöglichte die Identifizierung von stabilen Veränderungen, die selbst nach einer abgeklungenen Infektion noch erhalten blieben und das obwohl auf transkriptioneller Ebene eine komplette Rekonstitution des initialen, nicht infizierten Zustands auftrat. Wurden diese Zellen mit unterschiedlichen Stimuli induziert, wie zum Beispiel einer Re-Infektion mit KSHV, konnte zumindest für einen Teil der Gene eine deutlich stärkere transkriptionelle Antwort im Vergleich zu den Kontrollzellen festgestellt werden. Diese Daten deuten darauf hin, dass KSHV aktiv epigenetische Faktoren manipuliert, was zum einen den viralen Lebenszyklus beeinflusst, jedoch auch zu epigenetischen Veränderungen der Wirtszelle führt. Die Untersuchung der Zellen mit abgeklungener KSHV Infektion lassen die Vermutung zu, dass es neben KSHV abhängigen Veränderungen auch einen Anteil an deregulierten Regionen gibt, die Infektions-unabhängig werden. Beide Veränderungen könnten bei der KSHV abhängigen Tumorentstehung eine wichtige Rolle einnehmen, da dieser Prozess als Konsequenz einer latenten Langzeit-Infektion verstanden wird.