Kardialer und kardiomyozytärer Stoffwechsel in CRTC1‐defizienten Mäusen

Abstract

Herz‐Kreislauf‐Erkrankungen, häufig mit einer Herzhypertrophie einhergehend, sind die häufigsten Todesursachen in Deutschland. Es wird zwischen einer physiologischen und einer pathologischen Hypertrophie unterschieden, wobei die pathologische Hypertrophie zu einer Herzinsuffizienz führen kann. Zusammen mit kardialer Hypertrophie treten Veränderungen des Herzstoffwechsels auf, wobei nicht abschließend geklärt ist, ob diese Modifikationen eine Folge des kardialen Remodelings sind oder zur Pathogenese beitragen. Mäuse ohne den CREB‐regulierten Transkriptions‐Coaktivator CRTC1 (Crtc1‐/‐) entwickeln spontan eine milde Hypertrophie und kardiale Dysfunktion. Da RNA‐Seq‐ und Proteomics‐Analysen in Crtc1‐/‐ Mäusen Veränderungen der Expression von an Stoffwechselprozessen beteiligten mRNA und Proteinen zeigten, wurden in dieser Arbeit Gene für Schlüsselenzyme des kardialen Stoffwechsels und der Mitochondrienphysiologie von Crtc1‐/‐ Mäusen untersucht. Als Vergleich diente Herzgewebe von Mybpc3 Knock‐in (Mybpc3ki) Mäusen, einem etablierten Mausmodell für Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM). Im Kontrast zu Crtc1‐/‐ Mäusen wurde im Herzgewebe von Mybpc3ki Mäusen erhöhte CRTC1 mRNA- und Proteinmengen nachgewiesen. In Crtc1‐/‐ Mäusen wurde die mRNA Menge in 5‐6, 10‐13, 25‐30 und 45‐52 Wochen alten Mäusen gemessen und mit ihren Wildtypgeschwistertieren verglichen. Es wurde untersucht, ob eine Veränderung des Expressionsmusters von Genen für Schlüsselenzyme des kardialen Stoffwechsels und der Mitochondrienphysiologie in Abhängigkeit des Alters bei Crtc1‐/‐ Mäusen vorliegt. Die mRNA Expression von den Metabolismus und die Mitochondrien betreffenden Genen war in Herzen von Crtc1‐/‐ Mäusen größtenteils unverändert im Vergleich zu ihren Wildtypgeschwistertieren. Die mRNA Expression von für die Mitochondrienbiogenese essenziellen Genen wie Ppargc1a, mt‐Nd1 und Dnm1l war in Herzen der Mybpc3ki Mäuse verringert. Bei Crtc1‐/‐ Mäusen wurde keine veränderte mRNA oder Protein Expression von PGC‐1α gemessen, obwohl CRTC1 an den murinen PGC‐1α Promotor im Herzgewebe rekrutiert wurde. Der mitochondriale Transkriptionsfaktor A (TFAM) wird durch PGC‐1α induziert und die kardiale Tfam mRNA Expression war bei Crtc1‐/‐ Mäusen erhöht. Der Sauerstoffverbrauch kardialer Mitochondrien, gemessen mittels einer Clark‐Elektrode, war bei Crtc1‐/‐ Mäusen im Vergleich zu ihren Wildtypgeschwistertieren unverändert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen der linken Ventrikel von Crtc1‐/‐ Mäusen zeigten keine morphologischen Veränderungen der Mitochondrien. Ebenso war die mitochondriale Funktion gemessen anhand der Ca2+‐Retentionskapazität, des Membranpotentials sowie des Redoxstatus unverändert. In einem zweiten Projektteil wurde nach einer Gefäßverletzung in Carotisarterien eine verminderte Crtc mRNA Expression gemessen. Untersuchungen zur Regulation des Sphingosin‐1‐phosphat (S1P)‐Systems zeigten eine unveränderte mRNA Expression der S1P‐Rezeptoren sowohl in den Herzen als auch in den thorakalen Aorten von Crtc1‐/‐ Mäusen verglichen mit ihren Wildtypgeschwistertieren. Im Promotor‐Luciferase‐Reportergen Assay konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Ca2+ den humanen S1P‐Rezeptor 3 Promotor aktiviert (S1PR3), aber weder CREB noch CRTC1 wurden in Mausherzen an die Promotoren von S1PR3 oder der Sphingosinkinase 1 (SPHK1) rekrutiert. Zur Beschreibung des kardialen Phänotyps der Crtc1‐/‐ Mäuse wurde die Kontraktilität, Ca2+‐Handling und die Ca2+‐Sensitivität von Kardiomyozyten gemessen; sie zeigten keine Veränderungen im Vergleich mit ihren Wildtypgeschwistertieren. Anders als in vorherigen Arbeiten wurde in den Herzen der Crtc1‐/‐ Mäuse eine erhöhte Crtc2 und Crtc3 mRNA Expression gemessen. Konsistent mit vorherigen Ergebnissen wurden auch in dieser Arbeit wenige Effekte direkt auf der Ebene der Kardiomyozyten beobachtet. Zusammengenommen können die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese, dass CRTC1 an der Regulation kardialen Stoffwechsels auf zellulärer Ebene beteiligt sei, nicht bestätigen. CRTC1 könnte jedoch als ein zentraler Regulator des Metabolismus und des Sympathikotonus agieren.

Cardiovascular diseases, often accompanied by cardiac hypertrophy, are the most frequent causes of death in Germany. A distinction is made between physiological and pathological hypertrophy, whereby pathological hypertrophy can lead to heart failure. Together with cardiac hypertrophy, changes in cardiac metabolism occur, although it is not conclusively understood whether these modifications are a consequence of cardiac remodeling or contribute to the pathogenesis. Mice lacking the CREB‐regulated transcription coactivator CRTC1 (Crtc1‐/‐) spontaneously develop mild hypertrophy and cardiac dysfunction. Since RNA‐Seq and proteomics analyses in Crtc1‐/‐ mice showed alterations in the expression of mRNA and proteins involved in metabolic processes, genes for key enzymes of cardiac metabolism and mitochondrial physiology of Crtc1‐/‐ mice were investigated in this work. Heart tissue from Mybpc3 knock‐in (Mybpc3ki) mice, an established mouse model for hypertrophic cardiomyopathy (HCM), was used as a comparison. In contrast to Crtc1‐/‐ mice, increased CRTC1 mRNA and protein levels were detected in heart tissue from Mybpc3ki mice. In Crtc1‐/‐ mice, mRNA levels were measured in 5‐6, 10‐13, 25‐30 and 45‐52 week old mice and compared to their wild‐type littermates, to investigate whether there is an age‐dependent change in the expression pattern of genes encoding key enzymes of cardiac metabolism and mitochondrial physiology in Crtc1‐/‐ mice. The mRNA expression of genes related to metabolism and mitochondria was largely unchanged in hearts from Crtc1‐/‐ mice compared to their wildtype littermates. The mRNA expression of genes essential for mitochondrial biogenesis, such as Ppargc1a, mt‐Nd1 and Dnm1l, was decreased in hearts of Mybpc3ki mice. No altered mRNA or protein expression of PGC‐1α was detected in Crtc1‐/‐ mice, although CRTC1 was recruited to the murine PGC‐1α promoter in heart tissue. Mitochondrial transcription factor A (TFAM) is induced by PGC‐1α and cardiac Tfam mRNA expression was increased in Crtc1‐/‐ mice. Oxygen consumption of cardiac mitochondria measured by a Clark electrode was unchanged in Crtc1‐/‐ mice compared to their wild‐type littermates. Electron micrographs of the left ventricles of Crtc1‐/‐ mice showed no morphological changes in mitochondria. Similarly, mitochondrial function as measured by Ca2+ retention capacity, membrane potential and redox status was unchanged. In a second part of the project, reduced Crtc mRNA expression was measured in carotid arteries after vascular injury. Studies on the regulation of the sphingosine‐1‐phosphate (S1P) system showed unchanged mRNA expression of S1P receptors in both the hearts and thoracic aortas of Crtc1‐/‐ mice compared to their wild‐type littermates. In a promoter luciferase reporter gene assay, treatment with Ca2+ activated the human S1P receptor 3 promoter (S1PR3), but neither CREB nor CRTC1 were recruited to the promoters of S1PR3 or sphingosine kinase 1 (SPHK1) in murine cardiac tissue. To characterise the cardiac phenotype of the Crtc1‐/‐ mice, cardiomyocyte contractility, Ca2+ handling and Ca2+ sensitivity were measured; they showed no changes compared to their wildtype littermates. Unlike previous work, increased Crtc2 and Crtc3 mRNA expression was measured in the hearts of Crtc1‐/‐ mice. Consistent with previous results, few effects were observed directly at the cardiomyocyte level. Taken together, the results of this work do not confirm the hypothesis that CRTC1 is involved in the regulation of cardiac metabolism at the cellular level. However, CRTC1 may act as a central regulator of metabolism and sympathetic tone.