ATP11A causes autosomal-dominant progressive, non-syndromic auditory synaptopathy / auditory neuropathy

Abstract

Diese Arbeit untersucht die Phospholipid transportierende P4-ATPase ATP11A - ein neues Taubheitsgen, welches autosomal-dominant vererbte Auditorische Synaptopathie und Neuropathie (AS/AN) auslöst. Die krankheitsauslösende Mutation ist eine 5.500 bp große Deletion, die das letzte kodierende Exon beinhaltet. Bei dem dadurch ausgelösten abnormalen Spleißen wird ein alternatives letztes Exon verwendet, wodurch jedoch kein Stopcodon-vermittelter Abbau der mRNA ausgelöst wird. Immunfärbungen von HEK293 Zellen, die mit verschiedenen Varianten von ATP11A transfiziert wurden, belegen außerdem eine korrekte CDC50Aabhängige subzelluläre Lokalisation an der Plasmamembran. Ein Flippase Aktivitäts Assay mit dem NBD-markierten fluoreszierenden Phospholipid Phosphatidylserin (PS) zeigt, dass bei Vorhandensein der Mutation die Fähigkeit, PS von der exoplasmatischen zur cytoplasmatischen Seite der Membran zu transportieren, stark eingeschränkt ist. Eine künstlich erzeugte Variante des humanen ATP11A, die weder das physiologische, noch das alternative letzte Exon verwendet, ist im Experiment überaktiv. Dies legt nahe, dass die deletierte Sequenz des hATP11A für eine regulatorische Domäne kodiert. Die Regulation könnte entweder (i) aus einer einfachen längenabhängigen sterischen Hinderung des katalytischen Kerns bestehen oder aber (ii) auf einem Mechanismus basieren, der Ähnlichkeiten zu der Regulation des Hefeorthologs Drs2p aufweist, bei dem die Bindung eines Cofaktors Konformationsänderungen des inhibitorischen Peptids hervorruft. In der überaktiven Variante fehlt die autoinhibitorische Interaktion mit der deletierten C-terminalen Domäne vollständig. Die C-terminale Region des mutierten Proteins ist (i) zum einen länger als im Wildtyp und könnte daher zu stärkerer Deaktivierung führen, oder (ii) inhibiert die Aktivität auf einem ähnlichen Niveau wie im Wildtyp, durch die Deletion wird jedoch die Konformationsänderung und somit auch die Aktivierung der Flippasefunktion verhindert. Studien der Rolle von PS Translokation und der Verteilung innerhalb der Plasmamembran, sowie die Folgen von ATPase-Verlust in Mäusen, demonstrieren die Wichtigkeit der ATPasen in einer Vielzahl von zellulären Funktionen. Durch Veränderungen der asymmetrischen Verteilung von PS in der Plasmamembran könnten Störungen der Zellstabilität und -form, Endo- und Exozytose, Apoptose, Neuritdegeneration und -regeneration, ebenso wie Beeinträchtigungen des Ca2+ Spiegels und der Interaktion von Proteinen mit der Plasmamembran ausgelöst werden. Dies wiederum kann in der Konsequenz potentiell zu Degeneration von Zellen des Innenohrs führen. hATP11A-Funktionsreduktion als Ursache für eine neuartige Form von AS/AN zu identifizieren erweitert das Wissen über die Physiologie des Innenohrs und kann dazu beitragen, in Zukunft eine personalisiertere Medizin für Hörverlust zu entwickeln.

This thesis studies the phospholipid translocating P4-ATPase ATP11A, a novel deafness gene causing autosomaldominant inherited isolated auditory synaptopathy / auditory neuropathy (AS/AN). The causative mutation is a 5,500 bp deletion covering the last coding exon. This results in aberrant splicing with the use of an alternative last exon, without induction of nonsense-mediated mRNA decay. Immunohistochemistry of the transfected variant into HEK293T cells reveals correct CDC50A-dependent subcellular localisation to the plasma membrane. A flippase activity assay with the NBD-labelled fluorescent phospholipids phosphatidylserine (PS) displays a hypoactivity of PS translocating function from the exoplasmic to the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane in the presence of the mutation. An artificially constructed variant of human ATP11A having neither the physiological nor the alternative last exon, presented overly active. This suggests that the deleted sequence of hATP11A codes for a regulatory domain, acting (i) through simple lengthdependent sterical hindrance of the catalytic core or (ii) with a similar mechanism to the yeast ortholog Drs2p, where a cofactor activates a conformational change of the inhibitory peptide. In the overly active variant the autoinhibitory interaction with the deleted C-terminal domain is completely missing. In the mutant protein the altered C-terminal region is thought to be (i) either longer and therefore results in stronger deactivation or (ii) inhibits to a similar level compared to wild type peptide, but the deletion prevents the conformational change and thus the activation of flippase function. Studies on the role of PS tanslocation, distribution across the plasma membrane and the outcome of ATPase deficiency in mice demonstrate an importance of ATPases in a multitude of cellular functions. Disturbance in cell stability and shape, endo- and exocytosis, apoptosis, neurite degeneration and regeneration as well as impaired Ca2+ levels and interaction of proteins with the plasma membrane can be caused by changes in the asymmetry of PS in the plasma membrane and lead to subsequent degeneration of inner ear cells. Finding diminished hATP11A function to be the cause of a novel hereditary form of AS/AN broadens the knowledge of inner ear physiology and contributes to more personalised treatment of hearing loss in the future.