Targeting Clostridioides difficile CDTb and TcdB toxins with Nanobodies developed from Camelus dromedarius

Abstract

Clostridium difficile ist die Hauptursache für Antibiotika-assoziierten Durchfall und pseudomembranöse Kolitis in Europa und Nordamerika. Die zunehmende Inzidenz und Schwere der C. difficile assoziierte Erkrankung korreliert mit dem Auftreten hypervirulenter Stämme (BI/NAP1/027). Zusätzlich zu den großen glucosylierenden Toxinen TcdA und TcdB produzieren diese Stämme ein drittes binäres Toxin namens CDT, mit der enzymatischen Komponente CDTa - eine aktinspezifische ADP-Ribosyltransferase - und der hepatameren Bindungskomponente CDTb. Es besteht Bedarf an besseren diagnostischen Assays und spezifischen Therapien zur Behandlung der C. difficile assoziierten Erkrankung. Nanobodies, einzelne variable Immungloblulindomänen (VHHs) aus den Schwerekettenantikörpern (hcAb) der Cameliden, sind aufgrund ihrer hohen Löslichkeit, Stabilität, einfachen Neuformatierung und kostengünstigen Produktion, wertvolle Bausteine für neue Diagnostika und Therapeutika. Ziele der vorliegenden Arbeit waren, Nanobodies zu erzeugen und zu charakterisieren, die gegen die enzymatischen Domänen von TcdB (GTD-CPD) und die heptamere Bindungskomponente von CDT (CDTb) gerichtet sind, und mit diesen Nanobodies neue sensitive Nachweismethoden für diese Toxine in biologischen Proben zu entwickeln. Acht TcdB (CPD-GTD)-spezifische und fünf CDTb spezifische Nanobody-Familien wurden aus VHH-Phagen Display-Bibliotheken (die aus immunisierten Dromedaren hergestellt worden waren) mittels Panning an rekombinanten Toxinen gewonnen. Diese VHHs wurden in Kaninchen-IgG Schwereketten Antikörper (hcAb) umkloniert und als rekombinante Proteine in transient transfizierten HEK Zellen produziert. Kaninchen-hcAb, die nicht überlappende Epitope erkennen, wurden als Capture/Detektor Reagenzien für die Entwicklung von sensitiven Sandwich-ELISA verwendet. Die besten Antikörperpaare erreichten dabei eine Nachweisgrenze von 50-100 pg für CDTb und 10-30 pg für TcdB. Beide ELISAs konnten diese Toxine spezifisch in Stuhlproben von Mäusen nachweisen, die mit C. difficile-Sporen infiziert waren. Ein CDTb-spezifischer hcAb hemmte effektiv die durch CDT induzierte Zytotoxizität von humanen HT29 Zellen. Hingegen konnten, selbst in sehr hoher Konzentration, TcdB-spezifische hcAb die TcdB-vermittelte Zytotoxizität gegenüber HT29 Zellen nicht neutralisieren. Als Basis für therapeutische Anwendungen im Magen-Darm-Trakt wurden ausgesuchte CDTb-spezifische Nanobodies zudem in monomere und dimere Maus-IgA Schwereketten Antikörper formatiert, und in hoher Ausbeute in HEK Zellen hergestellt und für zukünftige Anwendungen in präklinischen Mausmodellen aufgereinigt. Die in dieser Arbeit entwickelten Nanobody-basierten IgG hcAb bilden die Grundlage für einen schnellen, sensitiven und spezifischen Nachweis von C. difficile Toxinen in biologischen Proben. Nach Validierung in präklinischen Mausmodellen könnten die Nanobody-basierten IgA hcAb für die Therapie von C. difficile assoziierte Erkrankung verwendet werden.