Adenine dinucleotide Ca2+ mobilizing second messengers modulate CD4+ T-cells differentiation and effector function

Abstract

CD4+ T cells orchestrate the immune response and Ca2+ signaling is essential for their activation and effector function. Adenine-derived Ca2+ mobilizing second messengers: adenine nucleotides nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP), adenine diphosphoribose (ADPR), and cyclic adenosine diphosphoribose (cADPR) have been identified as Ca2+ mobilizing secondary messengers in lymphocytes. Nevertheless, what are their functions in CD4+ T-cell biology remains to be unclear. Therefore, the first aim of this thesis was to address the question of importance of adenine-derived Ca2+ mobilizing second messenger in CD4+ T-cell activation, differentiation and effector function. In vitro assays were used to answer this question. Using OT-II mice and altered ovalbumin peptides, revealed that different TCR signal strength induces distinct Ca2+ signals and strong TCR signals promoted Th17 differentiation, whereas it inhibited iTreg differentiation. The role of NAADP signaling in the CD4+ T-cell biology was studied using the pharmacological blockade of NAADP by compounds BZ194 and trans-Ned 19. Both compounds diminished Ca2+ signaling and proliferation of naïve CD4+ T cells upon TCR stimulation. Interestingly, BZ194 decreased differentiation of Th17 cells and promoted development of iTregs in vitro, without having a significant effect on the Th1 differentiation. The other antagonist of NAADP signaling, trans-Ned 19, promoted Th17 and inhibited iTregs differentiation in vitro. Second, we used in vivo administration of trans-Ned-19. We found that trans-Ned-19 ameliorates disease severity in anti- CD3 mediated intestinal inflammation and nephrotoxic nephritis. The second aim of this thesis was to identify the molecular targets of adenine-derived second messengers in CD4+ T cells. TRPM2 channel is a putative target of NAADP and ADPR. CD4+ T-cell differentiation in vitro assays and investigation TRPM2 channel in vivo in the anti-CD3 model of intestinal inflammation revealed TRPM2 channel is not important for CD4+ T-cell biology in this model. Taken together, adenine derived Ca2+-mobilizing second messengers play a vital role in CD4+ T-cell biology. However, the identity of their target Ca2+ channels remains unclear. Dissection of adenine nucleotide mediated Ca2+ signaling in T cells requires the use of knockout mice deficient in RYR1 or TPC, enzymes producing and metabolizing the AN-derived second messengers and the accessory molecules, such as NAADP binding protein. Knowing the mechanics of the adenine nucleotide mediated Ca2+ signaling can contribute to the development of a novel class of immune modulating medication.

CD4+ T-Zellen steuern die Immunantwort und ihr Aktivierung und die Effektorfunktion ist von den Ca2+ Signalwegen abhängig. Adeninnukleotide (AN) Nikotinsäureadenindinukleotidphosphatn (NAADP), Adenindiphosphoribose (ADPR) und cyclische Adenosindiphosphoribose (cADPR) wurden als Ca2+ mobilisierende sekundäre Botenstoffe in Lymphozyten identifiziert. Welche Kalziumkanäle von diesen sekundären Botenstoffen moduliert werden und welche Funktionen sie in der CD4+ T-Zellbiologie haben, muss noch geklärt werden. Das erste Ziel dieser Arbeit ist es daher, die Bedeutung der von Adenin abgeleiteten Ca2+-mobilisierenden Second Messengern, für die Aktivierung, Differenzierung und Effektorfunktion von CD4+ T-Zellen zu klären. Wir verwendeten ein in vitro System, um diese Frage zu beantworten. Unter Verwendung von OT-IIMäusen und veränderten Ova Peptiden konnten wir zeigen, dass unterschiedliche TCRSignalstärken unterschiedliche Ca2+-Signale induzieren. Starke TCR-Aktivierung förderte die Th17-Differenzierung, während sie die iTreg-Differenzierung hemmte. Die Rolle der NAADPSignalübertragung in der CD4+ T-Zellbiologie wurde unter Verwendung der pharmakologischen Blockade von NAADP mithilfe der Substanzen BZ194 und trans-Ned 19 untersucht. Beide Substanzen verringerten das Ca2+-Signal und die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen bei TCRStimulation. Interessanterweise verringerte BZ194 die Differenzierung von Th17-Zellen und förderte die Entwicklung von iTregs in vitro, ohne einen signifikanten Einfluss auf die Th1- Differenzierung zu nehmen. Der andere Antagonist des NAADP-Signalwegs, trans-Ned 19, förderte Th17 und inhibierte die iTregs Differenzierung in vitro. Des Weiteren zeigte sich, dass in vivo die Anwendung von trans-Ned-19 zu einer verminderten Krankheitsaktivität bei anti-CD3-vermittelter Darmentzündung und nephrotoxischer Nephritis führt. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Ziele von Adenin-abgeleiteten Second Messengern in CD4+ T-Zellen zu identifizieren. Der TRPM2-Kanal ist ein vermeintliches Ziel von NAADP und ADPR. Die Differenzierung von CD4+ T-Zellen in vitro ergab, dass der TRPM2-Kanal für die IL-10- Produktion durch CD4 + T-Zellen wichtig sein könnte. Die Untersuchung des TRPM2-Kanals in vivo im Anti-CD3-Modell der Darmentzündung ergab, dass der TRPM2-Kanal für die CD4+ TZellbiologie in diesem Modell nicht relevant ist. Zusammenfassend spielen die von Adenin abgeleiteten Ca2+-mobilisierenden Second Messenger eine wichtige Rolle in der CD4+ TZellbiologie. Welche Ca2+-Kanäle durch diese Botenstoffe stimuliert werden, bleibt jedoch unklar. Zur Entschlüsselung der Adenin-Nucleotid-vermittelten Ca2+-Signalen in T-Zellen wird es erforderlich sein, Mäuse zu generieren, denen die RYR1 und TPC Ionkanäle fehlen. Alternativ wäre es auch möglich, Enzyme zu deletieren, die die von Adenin abgeleiteten Ca2+-mobilisierenden Botenstoffe produzuieren oder metabolisieren, sowie akzessorische Moleküle, wie das NAADPBindungsprotein. Die Kenntnis der Mechanismen der AN-vermittelten Ca2+-Signalisierung kann zur Entwicklung einer neuen Klasse immunmodulierender Medikamente beitragen.