Structural analysis of UBA5 and its binding partners

Abstract

Im Fokus der vorliegenden Arbeit lag die funktionelle und strukturelle Analyse der Aktivierungskaskade, welche zur Aktivierung des ubiquitinähnlichen Proteins Ubiquitin Fold Modifier 1 (UFM1) führt. Die an dieser Kaskade beteiligten Enzyme sind das Ubiquitin Fold Modifier Activating Enzyme 5 (UBA5), das Ubiquitin Fold Modifier Conjugating Enzyme 1 (UFC1) und das Ubiquitin Fold Modifier Ligating Enzyme 1 (UFL1). Im Genaueren sollte hier der erste Aktivierungsschritt strukturell untersucht werden, der in der Komplexbildung zwischen UFM1 und UBA5 besteht. Ein weiterer Aspekt der Untersuchung sollte die Frage beantworten, ob UFC1 und UFM1 ohne vorherige Aktivierung durch UBA5 einen Komplex bilden können. Ein weiterer Fokus lag bei der Evaluierung, ob das ATP-bindende Protein UBA5 für sogenannte „Pump-and-Probe-Experimente“ geeignet ist, um für zeitaufgelöste kristallographische Untersuchungen verwendet zu werden und um den Enzymmechanismus bei hoher Orts- und Zeitauflösung zu analysieren. Im Detail soll dabei ein stabiler Komplex hergestellt und kristallisiert werden, der aus UBA5 und einer caged Verbindung besteht. Caged-Verbindungen (engl. cage Käfig) sind chemische Verbindungen, die bei Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlängen das aktivierte Substrat freisetzen. Als caged-Verbindung wurde hierzu ein modifiziertes ATP mit der photolabilen Nitrophenyl-Ethylester- (NPE) Gruppe eingesetzt.

The focus of this work was the analysis of the activation cascade, which activates the ubiquitin-like protein Ubiquitin Fold Modifier 1 (UFM1). Proteins involved in this cascade are the Ubiquitin Fold Modifier Activating Enzyme 5 (UBA5), the Ubiquitin Fold Modifier Conjugating Enzyme 1 (UFC1) and the Ubiquitin Fold Modifier Ligating Enzyme 1 (UFL1). Explicitly, this work shall investigate the first activation step structurally, which consists of the complex formation between UFM1 and UBA5. Another aspect of the investigation engages the question if UFM1 and UFC1 can form a complex prior to the activation by UBA5. Another focus is the evaluation, if the ATP-binding protein is suitable for so called „pump-probe-experiments“ to investigate it with time resolved crystallographic experiments for analysis of the enzymatic mechanism with high resolution of time and space. In detail, it is necessary to produce and crystallize a stable complex consisting of UBA5 and a caged compound. Caged compounds are chemical compounds, which release its activated substrate upon radiation with light of specific wave lengths. The used caged compound group is a modified ATP with the photolabile nitrophenyl ethyl ester (NPE) group