Characterizing the microtubule-associated function of the B1-type cyclins in Arabidopsis thaliana and towards live cell imaging of meiosis in A. lyrata and A. arenosa

Abstract

In mitosis, a precise duplication and equal distribution of the genomic DNA between daughter cells is essential for genome stability and growth. For such a precise division, eukaryotes make use of a set of cytoskeletal arrays, which are composed mainly of microtubule filaments. Because plant cells cannot move as opposed to animal cells, plants rely on a precise cell division site determination for organ growth and patterning. Accordingly, plants have developed specific microtubule-based structures for cell divisions, such as the preprophase band (PPB) and the phragmoplast. The PPB is a band of microtubules that forms before division at the cell cortex around the equator of the nucleus. It is known to mark the periphery of the division plane and anchor proteins that remain there throughout cell division, acting as fiducial markers. The spindle, which appears after the PPB has disassembled and the nuclear envelope has broken down, is essential for accurate sister chromatid segregation. After sister chromatids have been segregated, the phragmoplast forms, which guides accurate membrane and cell wall formation between the two daughter nuclei, ensuring a successful cell division.

The progression of the cell cycle is tightly regulated by cyclins and cyclin-dependent kinases (CDKs). They act together to phosphorylate a plethora of substrates, with specificity provided by both the cyclin and CDK partner. Phosphorylation can promote rapid changes in protein activity, which is in accordance with the significant changes in microtubule conformation throughout cell division. Here, in the first chapter, I have characterized the function of the five-member CYCLIN B1 group in Arabidopsis thaliana. I show that the function of B1-type cyclins is highly redundant and tissue-dependent. Interestingly, mutants for B1-type cyclin members have compromised microtubule arrays, including misplaced and double PPBs, as well as chromosome laggards in metaphase and abnormal phragmoplasts. I further reveal that B1-type cyclins, especially together with CDKB2;2, can phosphorylate a key microtubule nucleation factor in vitro, MOZART1/GIP1. Accordingly, I show that GIP1 mislocalizes in a B1-type cyclin mutant background.

In the second chapter, I explore in detail the function of B1-type cyclin-dependent phosphorylation of two microtubule-associated proteins. First, I test the function of MOZART1/GIP1 phosphorylation by generating two GIP1 versions with residues that cannot be phosphorylated (alanine) in a gip1 gip2 background and analyzing the phenotype of these plants. Second, being unable to detect a clear phenotype in these GIP1 versions in gip1 gip2, I also test the function of phosphorylation of another microtubule-associated protein, namely ENDOSPERM DEFECTIVE 1 (EDE1). EDE1 is an essential member of the augmin complex in mitosis and promotes branched microtubule-dependent microtubule nucleation. After mutating eight EDE1 residues into alanine and introducing this construct in a mutant ede1-1 background, I detected a clear impact on spindle architecture and dynamics compared to the wild-type EDE1 in an ede1-1 background. Hence, I was able to find a direct link between cyclin-CDK-dependent phosphorylation and microtubule array regulation in mitosis.

In sexually-reproducing organisms, a special cell division called meiosis takes place. Meiosis, unlike mitosis, is reductional and key for gamete formation. Since chromosomes must pair to segregate equally during meiosis I, polyploids, i.e., organisms that possess three or more chromosome sets, have an extra challenge to produce balanced gametes. Surprisingly, established polyploids have evolved to possess stable meiosis and accurate chromosome segregation. In the third chapter, I describe an attempt of using the outcrossing A. lyrata and A. arenosa species as models for polyploid meiosis. Following meiotic cell divisions live in these species, similar to what has been recently achieved in A. thaliana, could provide us key insights into meiotic adaptations to polyploidy. However, generating reporter lines in those plants was a challenge and I describe my attempts in this thesis.

In der Mitose ist eine präzise Verdopplung und gleichmäßige Verteilung der genomischen DNA zwischen den Tochterzellen für die Stabilität des Genoms und das Wachstum unerlässlich. Für eine solche präzise Teilung nutzen Eukaryoten eine Reihe von Zytoskelettanordnungen, die hauptsächlich aus Mikrotubuli-Filamenten bestehen. Da sich Pflanzenzellen im Gegensatz zu tierischen Zellen nicht bewegen können, sind sie für das Wachstum und die Strukturierung von Organen auf eine präzise Bestimmung der Zellteilungsstelle angewiesen. Dementsprechend haben Pflanzen spezifische Mikrotubuli-basierte Strukturen für die Zellteilung entwickelt, wie das Präprophasenband (PPB) und den Phragmoplast. Das PPB ist ein Band aus Mikrotubuli, welches sich vor der Teilung an der Zellrinde (Pellicula) um den Äquator des Zellkerns bildet. Es markiert die Peripherie der Teilungsebene und verankert Proteine, die während der gesamten Zellteilung dort verbleiben und als Referenzmarker dienen. Die Spindel, die nach dem Abbau der PPB und dem Zerfall der Kernhülle entsteht, ist für die genaue Segregation der Schwesterchromatiden unerlässlich. Nach der Segregation der Schwesterchromatiden bildet sich der Phragmoplast, der die korrekte Membran- und Zellwandbildung zwischen den beiden Tochterkernen leitet und so eine erfolgreiche Zellteilung gewährleistet.

Der Ablauf des Zellzyklus wird durch Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) streng reguliert. Sie wirken zusammen und phosphorylieren eine Vielzahl von Substraten, wobei die Spezifität sowohl durch das Cyclin als auch durch den CDK-Partner gewährleistet wird. Die Phosphorylierung kann zu schnellen Veränderungen der Proteinaktivität führen, was mit den erheblichen Veränderungen der Mikrotubuli-Konformation während der Zellteilung in Einklang steht. Im ersten Kapitel habe ich die Funktion der CYCLIN B1-Gruppe in Arabidopsis thaliana charakterisiert, welche aus fünf Mitgliedern besteht. Ich zeige, dass die Funktion der B1-Typ-Cycline hochgradig redundant und gewebeabhängig ist. Mutanten in Cyclinen des B1-Typs weisen beeinträchtigte Mikrotubuli-Anordnungen auf, darunter fehlplatzierte und doppelte PPBs, sowie Nachzüglerchromosome in der Metaphase und abnorme Phragmoplasten. Ich zeige außerdem, dass B1-Cycline, insbesondere zusammen mit CDKB2;2, einen wichtigen Mikrotubuli-Nukleationsfaktor, MOZART1/GIP1, in vitro phosphorylieren können. Dementsprechend zeige ich, dass GIP1 in einem Mutantenhintergrund des B1-Typ-Cyclins fehllokalisiert ist.

Im zweiten Kapitel untersuche ich im Detail die Funktion der B1-Typ-Cyclin-abhängigen Phosphorylierung von zwei Mikrotubuli assoziierten Proteinen. Zunächst teste ich die Funktion der MOZART1/GIP1-Phosphorylierung, indem ich zwei GIP1-Versionen mit Resten, die nicht phosphoryliert werden können (Alanin), in einem gip1 gip2-Hintergrund erzeugte und den Phänotyp dieser Pflanzen analysierte. Da ich bei diesen GIP1-Versionen in gip1 gip2 keinen eindeutigen Phänotyp feststellen konnte, habe ich außerdem die Funktion der Phosphorylierung eines anderen Mikrotubuli-Proteins, nämlich ENDOSPERM DEFECTIVE 1 (EDE1), untersucht. EDE1 ist ein wesentliches Mitglied des Augmin-Komplexes in der Mitose und fördert die von verzweigten Mikrotubuli abhängige Mikrotubuli-Nukleation. Nachdem ich acht EDE1-Reste zu Alanin mutiert und dieses Konstrukt in einen mutierten ede1-1-Hintergrund eingebracht hatte, konnte ich im Vergleich zum Wildtyp-EDE1 in einem ede1-1-Hintergrund deutliche Auswirkungen auf die Spindelarchitektur und -dynamik feststellen. Somit konnte ich eine direkte Verbindung zwischen der Cyclin-CDK-abhängigen Phosphorylierung und der Regulierung der Mikrotubuli-Anordnung in der Mitose feststellen.

Bei sich sexuell fortpflanzenden Organismen findet eine spezielle Zellteilung statt, die Meiose. Im Gegensatz zur Mitose ist die Meiose reduktiv und entscheidend für die Bildung der Gameten. Da sich die Chromosomen während der Meiose I paarweise und gleichmäßig teilen müssen, ist es für Polyploide, d. h. Organismen mit drei oder mehr Chromosomensätzen, eine besondere Herausforderung, ausgewogene Gameten zu erzeugen. Überraschenderweise haben sich etablierte Polyploide so entwickelt, dass sie eine stabile Meiose und eine genaue Chromosomentrennung aufweisen. Im dritten Kapitel beschreibe ich einen Versuch, die sich auskreuzenden Arten A. lyrata und A. arenosa als Modelle für die polyploide Meiose zu verwenden. Wenn man die meiotischen Zellteilungen bei diesen Arten live verfolgt, ähnlich wie es kürzlich bei A. thaliana gelungen ist, könnte man wichtige Erkenntnisse über die meiotischen Anpassungen an die Polyploidie gewinnen. Die Erzeugung von Reporterlinien in diesen Pflanzen war jedoch eine Herausforderung, und ich beschreibe meine Versuche in dieser Arbeit.