Genomweite Bestimmung von Chromatindichte und polycistronischer RNA-Synthese im Zuge der Stadiendifferenzierung des humanpathogenen Parasiten Leishmania donovani (Ross, 1903)

Abstract

Leishmaniose zählt zu den bedeutendsten vernachlässigten Tropenkrankheiten weltweit und wird von einzelligen, protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania verursacht. Die Krankheitsformen unterscheiden sich in kutane, mukokutane und viszerale Leishmaniose, wobei letztere ohne Behandlung zum Tod führt. Die therapeutischen Optionen bei Leishmaniose beruhen auf Chemotherapie, die z.T. hohe Nebenwirkungen haben. Eine effektive Impfung gibt es bislang nicht. Diese Arbeit befasst sich mit dem humanpathogenen Erreger der viszeralen Leishmaniose, L. donovani. Leishmania spp. durchlaufen während des Lebenszyklus eine Stadiendifferenzierung: längliche, begeißelte Promastigoten, die im Mitteldarm der Sandmücke leben, differenzieren bei einer Übertragung auf einen Säugetier-Wirt zu eiförmigen, unbegeißelten Amastigoten. Die Differenzierung wird durch eine erhöhte Temperatur und ein saures Milieu im Phagolysosom von phagozytierenden Zellen ausgelöst. In L. donovani kann diese Stadiendifferenzierung zum einen chemisch durch eine Hemmung des Hitzeschockproteins 90 und zum anderen durch eine Temperatur/pH-induzierte Differenzierung zu axenischen Amastigoten nachgeahmt werden. Die Stadiendifferenzierung ist von zentraler Bedeutung für die erfolgreiche Etablierung der Leishmania-Infektion im Wirt. Dabei zeigen diese Parasiten eine ungewöhnliche Regulation der Genexpression im Vergleich zu anderen Eukaryoten. Gene sind in Tandem-artigen Transkriptionseinheiten organisiert und werden polycistronisch transkribiert, wodurch eine Regulation der Transkription einzelner Gene unmöglich ist. Genexpression wird in Leishmania spp. auf anderen Stufen, wie Genkopien-Zahlen, mRNA-Stabiltät und Translation reguliert. Ribosome profiling-Analysen, die sich mit der Proteinsynthese vor dem Hintergrund der chemisch-induzierten Differenzierung durch Radicicol (RAD) befassten, zeigten eine erhöhte Histonsynthese im Vergleich zu Promastigoten. In dieser Arbeit konnte ich durch micrococcal nuclease Assays zeigen, dass die erhöhte Histonsynthese in RAD-behandelten Promastigoten mit einer dichteren Chromatinstruktur eingeht. Diese verdichtete Chromatinstuktur wurde auch für axenische Amastigotendifferenzierung und einen Hitzeschock bei 37 °C beobachtet, aber nicht bei einem G1-Zellzyklusarrest. Nachfolgend habe ich durch die Etablierung von ATAC-seq, einem Assay für Transposase-zugängliches Chromatin in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung, feststellen können, dass vor allem Regionen der Transkriptionsinitiation ein dichteres Chromatin bei chemisch- und Temperatur/pH-induzierter Differenzierung aufweisen. Sowohl divergente strand switch regions (dSSR), die zwischen zwei divergenten polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTU) liegen, und Telomerregionen stromaufwärts des Transkriptionsstarts zeigten diese Verdichtung. Um zu prüfen, ob das dichtere Chromatin in den Regionen der Transkriptionsinitiation zu einer verringerten Transkription bei chemisch- und Temperatur/pH- induzierter Differenzierung führt, habe ich PRO-seq, eine hochauflösende nuclear run-on Reaktion mit anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung, in L. donovani etabliert, die erste Anwendung dieser Methode in Trypanosomatida. Die Ergebnisse bestätigten endgültig, dass das Genom von L. donovani in PTUs organisiert ist, konstitutiv transkribiert wird und die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene reguliert wird. Eine Auswirkungen der dichteren Chromatinstuktur in dSSRs auf die Transkriptionsinitiation bei HSP90-Hemmung und axenischer Amastigotendifferenzierung konnte nicht festgestellt werden. Eine detaillierte, vergleichende Analyse aller divergenten und konvergenten SSRs in Promastigoten, RAD- behandelten Promastigoten und axenischen Amastigoten zeigte, dass Transkriptionsinitiation und -termination jeweils in den gleichen Bereichen stattfindet, was das Vorhandensein von definierbaren Transkriptions-Startpunkten vermuten lässt. Außerdem wurden Hinweise auf pausierte RNA Polymerase II Komplexe gefunden, weshalb sich in zukünftigen Analysen die Frage stellt, welchen Einfluss promoter-proximal pausing in der Transkription von Leishmania spp. hat.