Optogenetic manipulation of intracellular cyclic nucleotides in hippocampal neurons

Abstract

The second messenger cAMP is an ubiquitously important molecule that controls an impressive number of intracellular functions, from cell division, motility, metabolism and gene expression. In the hippocampus, cAMP is thought to induce long term-potentiation of synaptic connections, a process considered to represent the cellular correlate of learning and memory storage. At the Schaffer collateral CA1 synapse, cAMP-dependent induction of LTP is thought to be a postsynaptic process, characterised by an increase in glutamate receptor number and conductance, as well as expression of immediate-early genes. However, due to the lack of spatial and temporal resolution of classical pharmacology, it cannot be differentiated between pre and postsynaptic cAMP sites of action, nor can individual cell contributions be evaluated. For this reason, during my PhD I have worked on the development of photoactivatable adenylyl cyclases that can be expressed and activated in cell types of interest and specific synaptic compartments, ensuring a higher spatial resolution of cAMP manipulation. In this work I present the development and characterisation of multiple optogenetic tools with which one can optogenetically elevate intracellular cAMP with high spatial and temporal resolution (PACmn, RhAC). To establish if optogenetic elevation of cAMP in excitatory neurons is sufficient on its own to enhance transmission at hippocampal Schaffer collateral synapse, I expressed PACmn in population and single cells. While global optogenetic cAMP elevation mimics the effects of pharmacological treatment, the effects are not restricted to postsynaptic cAMP, as presynaptic cAMP elevation also induces transient potentiation at the Schaffer collateral. Furthermore, global optogenetic cAMP induces cFos expression in CA1 neurons, regardless if elevated pre or postsynaptically. However, it is not possible to induce cFos expression or LTP in individual CA1 pyramidal cells, indicating that the pathways leading from cAMP via PKA/EPAC to CREB activation and immediate early gene expression are not functional in resting neurons and that action potential firing and synaptic transmission are required.

Der Second Messenger cAMP steuert eine beeindruckende Anzahl intrazellulärer Funktionen, von Zellteilung und Motilität über Stoffwechsel bis zu Genexpression. Es wird angenommen, dass cAMP im Hippocampus die langfristige Potenzierung synaptischer Verbindungen (LTP) induziert, ein Prozess, der als zelluläres Korrelat von Lernen und Gedächtnis angesehen wird. An den Synapsen zwischen CA3- und CA1-Pyramidenzellen (Schaffer Kollaterale) wird die cAMP-abhängige Induktion von LTP als postsynaptischer Prozess angesehen, der durch eine Zunahme der Anzahl und Leitfähigkeit von Glutamat-Rezeptoren sowie durch Expression von Immediate-Early-Genen gekennzeichnet ist. Aufgrund der breitbandigen Wirkung klassischer Pharmakologie besteht jedoch Unsicherheit, ob cAMP prä- oder postsynaptisch wirkt, und eine eventuelle Beteiligung nicht-neuronaler Zellen (Astrozyten, Microglia) kann ebenfalls nicht ausgeschlossen werden. Um die Mechanismen cAMP-abhängiger Plastizität besser untersuchen zu können, habe ich während meiner Promotion an der Entwicklung photoaktivierbarer Adenylylzyklasen gearbeitet, die in genetisch definierten Zelltypen und spezifischen synaptischen Kompartimenten exprimiert und aktiviert werden können, um zellspezifische und zeitlich präzise cAMP-Manipulation zu ermöglichen. In dieser Arbeit präsentiere ich die Entwicklung und Charakterisierung mehrerer optogenetischer Werkzeuge, mit denen man intrazelluläres cAMP mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung optogenetisch erhöhen kann (PACmn, RhAC). Darüber hinaus war ich an der Entwicklung eines neuartigen Werkzeugs zur neuronalen Hemmung beteiligt, in dem eine photoaktivierbare Cyclase mit einem zyklischen Nukleotid-gesteuerten Kaliumkanal kombiniert ist. Um festzustellen, ob die optogenetische Erhöhung von cAMP in exzitatorischen Neuronen allein ausreicht, um die Übertragung an der hippocampalen Schaffer-Kollateral- synapse zu potenzieren, exprimierte ich PACmn in einzelnen Zellen oder viral in größeren Zellgruppen. Obwohl globale optogenetische cAMP-Erhöhung ähnliche Konsequenzen wie die pharmakologische cAMP-Erhöhung hatte, ist die Wirkungen nicht durch postsynaptisches cAMP zu erklären, da eine cAMP-Erhöhung in den präsynaptischen Zellen (CA3) auch eine transiente Potenzierung der Schaffer-Kollateralsynapse induzierte. Expression von cFos in CA1-Neuronen war unabhängig davon, ob cAMP prä- oder postsynaptisch erhöht wurde. Es ist jedoch nicht möglich, cFos-Expression oder LTP in einzelnen CA1-Pyramidenzellen zu induzieren, was darauf hindeutet, dass die klassischen zellautonomen Signalwege, die von cAMP über PKA/EPAC zur CREB-Aktivierung und Expression von Immediate-Early-Genen führen, cAMP-induzierte synaptische Plastizität nicht erklären können. Meine Arbeit legt nahe, dass die konzertierte Aktivität vieler Neuronen und Glutamat-Freisetzung für die Aktivierung von CREB notwendig sind.