Dual NADPH oxidase 2 – the NAADP forming enzyme in T cells

Abstract

T-Zellen gehören zu den Hauptkomponenten der adaptiven Immunantworten und eine Dysfunktion führt zu Autoimmun- und Entzündungserkrankungen. Die Aktivierung des T-Zell-Rezeptors (TCR) auf der Oberfläche der T-Zellen ist für die Immunreaktion erforderlich. Sobald der TCR antigene Informationen von den Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) erkennt, werden sekundäre Botenstoffe (second messengers) gebildet, die für die Weiterleitung der Signale in den intrazellulären Bereich verantwortlich sind. Ein wichtiger Transduktionsmechanismus ist der Anstieg der freien Ca2+-Konzentration im Zytosol. Sowohl der Ca2+-Einstrom aus dem Extrazellulärraum als auch die Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Organellen tragen hierbei zum Anstieg der freien zytosolischen Ca2+-Konzentration bei. In CD4+-T-Zellen wird Nikotinsäure-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NAADP) innerhalb von Sekunden nach der TCR-Stimulation gebildet. Wenn NAADP an das hämatologisch und neurologisch exprimierte 1-ähnliche Protein/Jupiter microtubule-associated homolog 2 (HN1L/JPT2) gebunden ist, werden initiale Ca2+-Signale, durch die Öffnung des Typ-1-Ryanodinrezeptors (RyR1s) in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) ausgelöst, die als Ca2+-Mikrodomänen beschrieben sind. Diese initialen Ca2+-Signale werden anschließend durch D-myo-Inositol-1,4,5-Trisphosphat (InsP3)- und zyklische Adenindiphosphat-Ribose (cADPR)-induzierte Ca2+-Freisetzung sowie Calcium-induzierte Ca2+-Freisetzung (CICR) und den speichergesteuerten Ca2+-Einstrom (SOCE) verstärkt. Die durch NAADP ausgelösten initialen Ca2+-Signale sind für die T-Zell-Aktivierung und deren nachgeschaltete Funktion entscheidend. Das NAADP-bildende Enzym in T-Zellen ist jedoch nach wie vor nicht bekannt. Durch den Einsatz eines Mikroskops mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung (25 ms und 368 nm) ist es möglich, die innerhalb von Sekunden nach der TCR-Aktivierung entstehenden Ca2+-Signale zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden die innerhalb von 15 Sekunden gebildeten Ca2+-Mikrodomänen als primäre Messgröße zur Untersuchung der NAADP-Synthese nach der T-Zell-Aktivierung verwendet. Da die durch NAADP ausgelösten initialen Ca2+-Signale maßgeblich für die Entwicklung eines globalen Ca2+-Signals sind wurden darüber hinaus auch die globalen Ca2+-Signale innerhalb von 13 Minuten nach der T-Zell-Aktivierung analysiert. Es hat sich gezeigt, dass CD38 und die NADPH-Oxidasen in der Lage sind, NAADP in einem zellfreien System zu bilden. In dieser Studie wurden CD4+ T-Zellen aus verschiedenen Mausmodellen und mit CRISPR/Cas entwickelte Ratten-Effektor-T-Zellen verwendet, um die Beteiligung dieser Enzyme an der NAADP-Synthese in intakten T-Zellen zu untersuchen, d. h. die Ca2+ Signale während der frühen Phase der T-Zell-Aktivierung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Abwesenheit von CD38 weder die Bildung von initialen Ca2+-Mikrodomänen noch die anschließenden globalen Ca2+-Signale verändert, was darauf hindeutet, dass CD38 nicht das NAADP-bildende Enzym in CD4+-T-Zellen ist. Ein Isozym der NADPH-Oxidasen, nämlich die duale NADPH-Oxidase 2 (DUOX2), konnte als verantwortlich für die NAADP-Bildung bei der T-Zell-Aktivierung identifiziert werden. Die Abwesenheit von DUOX2 reduzierte signifikant die Bildung von initialen Ca2+-Mikrodomänen und die globalen Ca2+-Signale nach TCR-Stimulation, was mit den zuvor veröffentlichten Phänotypen übereinstimmt, wenn der NAADP/Ca2+-Weg gestört ist. Außerdem konnte die Rolle von H2O2, einem Nebenprodukt der DUOX-Enzyme, auf die Entstehung von initialen Ca2+-Signalen ausgeschlossen werden: das H2O2 abbauende Enzym Kalatase, der ROS-Fänger Butylhydroxyanisol (BHA), die Blockierung der H2O2-Aufnahme und die Zugabe von 80 nM exogenoem H2O2 veränderten die Bildung von initialen Ca2+-Mikrodomänen nicht. Darüber hinaus liegt die H2O2-Produktion innerhalb 50 s nach der TCR-Stimulation unter 300 nM, wie mit dem H2O2-indikator HyPer7 nachgewiesen wurde. Insgesamt wurde festgestellt, dass DUOX2 innerhalb von Sekunden nach der T-Zell-Aktivierung eine entscheidende Rolle bei der NAADP-Produktion spielt und dass das Nebenprodukt H2O2 in diesem Zeitraum keine Auswirkung auf die initialen Ca2+ Signale hat.