Characterization of HN1L: a novel signaling protein connecting NAADP and Ca2+ microdomain formation in T cells

Abstract

Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) is the most potent calcium ion (Ca2+) mobilizing secondary messenger targeting ryanodine receptor type 1 (RYR1) for Ca2+ release from ER in T cells. It has been reported to evoke the earliest local Ca2+ signals, also termed Ca2+ microdomains, during activation of T cells. Photoaffinity labelling (PAL) revealed that NAADP binds to a small cytosolic protein (NAADPbinding protein) of 22/23 kDa size, which then together activates the RYR1 localized on membrane of the endoplasmic reticulum (ER). Our group identified the 22/23 kDa protein to be hematological and neurological expressed 1–like protein (HN1L), also called jupiter microtubule-associated homolog 2 (JPT2). This thesis further characterizes the identified protein, HN1L, by assessing its binding towards NAADP and elucidating its role in NAADP-mediated Ca2+ signaling in T cells. PAL with recombinant HN1L showed strong labelling by the probe which was displaced by NAADP in nanomolar range suggesting that HN1L is a highly specific NAADP-binding protein. Further, PAL with deletion mutants of HN1L provided insights that NAADP binds to latter half of HN1L close to the Cterminal end. Functional knockout of hn1l in Jurkat T cells resulted in delayed onset and reduced amplitude of global Ca2+ signaling. Fast and local Ca2+ imaging of hn1l-/- Jurkat T cells showed that the number of initial Ca2+ microdomains reduced significantly upon activation. Similar effects on both local and global Ca2+ signals were obtained by knocking out hn1l in rat primary T cells. Impaired Ca2+ signaling in the absence of HN1L in two different systems strongly claims that it has an important signaling function in NAADP signalosome in T cells. Super-resolution via optical reassignment (SoRa) imaging showed that HN1L and RYR colocalize at ERplasma membrane (PM)-junction and upon stimulation, HN1L was found to translocate towards the PM suggesting a role of HN1L at ER-PM junction during activation of T cells. The structural data showed that HN1L and NAADP interact with SPRY2 (domain 2 found in splA kinase and ryanodine receptors) and bridging solenoid (Bsol) domains of RYR1, strongly supporting the colocalization findings. Furthermore, the open probability (Po) of RYR1 increased significantly in the presence of HN1L and NAADP. Overall, a strong association between HN1L and RYR1 has been shown. Taken together, the data presented in this thesis demonstrates that HN1L functions as a NAADP-binding protein enabling NAADP to evoke Ca2+ release from ER via RYR1 in T cells.

Nicotinsäureadenindinukleotidphosphat (NAADP) ist der potenteste, Calciumion (Ca2+) mobilisierende sekundäre Botenstoff, der den Ryanodinrezeptor Typ 1 (RYR1) öffnet und so die Ca2+ Freisetzung aus dem ER in T-Zellen vermittelt. Es wurde berichtet, dass NAADP die frühesten lokalen Ca2+ Signale während der Aktivierung von T-Zellen hervorruft, die auch als Ca2+ Mikrodomänen bezeichnet werden. Durch Photoaffinitätsmarkierung (PAL) konnte gezeigt werden, dass NAADP an ein kleines zytosolisches Protein (NAADP-bindendes Protein) mit einer Größe von 22/23 kDa bindet, das dann gemeinsam den RYR1 an der Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER) aktiviert. Unsere Gruppe konnte ein 22/23 kDa großes Protein als hematological and neurological expressed 1–like protein (HN1L) identifizieren, das auch als jupiter microtubule-associated homolog 2 (JPT2) bezeichnet wird. In dieser Arbeit wurde das identifizierte Protein, HN1L, weiter charakterisiert indem seine Bindung an NAADP und seine Signalfunktion bei der NAADP-vermittelten Ca2+ Signalübertragung in T-Zellen untersucht wurde. PAL mit rekombinantem HN1L zeigte eine starke Bande durch die Sonde, welche durch NAADP im nanomolaren Bereich verdrängt werden konnte, was darauf schließen lässt, dass HN1L ein hochspezifisches NAADP-bindendes Protein ist. Darüber hinaus wurden PAL-Experimente mit Deletionsmutanten von HN1L durchgeführt, wodurch das C-terminale Ende als NAADP bindende Stelle identifiziert wurde. Der funktionelle Knockout von hn1l in Jurkat-T-Zellen führte zu einem verzögerten Einsetzen und einer reduzierten Amplitude von globalen Ca2+ Signalen. Schnelle und lokale Ca2+ Mikroskopie von hn1l-/- Jurkat T-Zellen zeigte, dass die Anzahl der initialen Ca2+ Mikrodomänen nach der Aktivierung deutlich abnahm. Ähnliche Auswirkungen auf lokale und globale Ca2+ Signale wurden durch KO von hn1l in primären TZellen der Ratte verifiziert. Die Beeinträchtigung der Ca2+ Signalübertragung in Abwesenheit von HN1L in zwei verschiedenen Systemen deutet darauf hin, dass es eine wichtige Funktion im NAADP-Signalosom in T-Zellen hat. Super-Resolution via Optical Reassignment (SoRa) Mikroskopie zeigte, dass HN1L und RYR an der ERPlasmamembran (PM)-Kontaktstelle ko-lokalisieren und dass HN1L bei Stimulation in Richtung PM transloziert, was auf eine Rolle von HN1L während der Aktivierung von T-Zellen an der ER-PMKontaktstelle schließen lässt. Zusätzlich zeigten Strukturdaten, dass HN1L zusammen mit NAADP mit den SPRY2 (domain 2 found in splA kinase and ryanodine receptors)- und bridging solenoid (Bsol)-Domänen von RYR1 interagieren, was die Ergebnisse der Ko-lokalisierung weiter unterstützt. Außerdem stieg die Öffnungswahrscheinlichkeit (Po) von RYR1 in Gegenwart von HN1L und NAADP deutlich an. Insgesamt konnte eine starke Verbindung zwischen HN1L und RYR1 nachgewiesen werden. Insgesamt zeigen die in dieser Arbeit vorgelegten Daten, dass HN1L als NAADP-bindendes Protein fungiert, welches die Ca2+ Freisetzung aus dem ER über RYR1 durch Bindung an NAADP in T-Zellen vermittelt.