Analyse des intestinalen Invasionsprozesses von Entamoeba histolytica (SCHAUDINN, 1903) unter Verwendung eines humanen 2D-Organoidmodells

Abstract

Das intestinale Protozoon Entamoeba histolytica zählt als Auslöser der Amöbiasis vor allem in tropischen Regionen mit schlechten hygienischen Standards, zu einem wichtigen humanen Parasiten. Die Trophozoiten können Monate bis Jahre im Darm ihres Wirtes leben ohne dabei Symptome auszulösen. Jedoch kommt es in rund 10% der Infektionen zu einer invasiven Verlaufsform, wobei die Trophozoiten die Darmwand des Wirtes penetrieren und in den Blutstrom gelangen können. Häufig endet diese Verlaufsform in der Leber mit der Bildung von, für den Wirt tödlichen, Leberabszessen. Die genauen Umstände und Faktoren einer solchen Verlaufsform sind weitestgehend ungeklärt. Bisher konnten vor allem Cysteinproteasen, Gal/GalNAc Lektine und amoebapores als wichtige Pathogenitätsfaktoren von E. histolytica beschrieben werden. Für die Identifizierung neuer Pathogenitätsfaktoren wurden bisher oft vergleichende Studien von nicht-pathogenen und pathogenen Isolaten durchgeführt. In einer vergleichenden Transkriptomstudie der Klone A1np und B2p, die sich in ihrer Pathogenität unterscheiden, jedoch beide von dem Isolat HM-1:IMSS abstammen, wurden eine Reihe von unterschiedlich exprimierten Genen identifiziert. Pathogenität beschreibt dabei die Fähigkeit Amöbenleberabszesse nach intrahepatischer Injektion im Tiermodell auszulösen. Dabei konnte für das Gen ehi_200230, welches für die Metalloprotease EhMP8-2 codiert, eine ca. 150-fach höhere Expression in dem nicht-pathogenen Klon A1np im Vergleich zu dem pathogenen Klon B2p nachgewiesen werden. Die Überexpression der ehmp8-2 in dem pathogenen Klon B2p führte zu einer signifikanten Reduktion der Pathogenität, während das silencing in einem nicht-pathogenen Klon zu einer signifikanten Steigerung der Pathogenität führte. In dem Genom von E. histolytica befindet sich noch ein weiteres Gen, was für die Metalloprotease EhMP8-1 codiert. Diese ist in den beiden Klonen gleichermaßen exprimiert. In der vorliegenden Dissertation sollte zunächst der Prozess der Gewebeinvasion von E. histolytica anhand eines humanen, intestinalen 2D-Organoidmodells untersucht werden. Dabei wurden Trophozoiten der beiden Klone A1np und B2p sowie Transfektanten der beiden Klone in denen die Expression der Metalloproteasen mittels RNAi-basiertem silencing gehemmt wurde mit den Organoidkulturen co-inkubiert. Die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER), ebenso wie eine mikroskopische Analyse, konnte dabei keinen Unterschied in der Zerstörung des Zellrasens zwischen den beiden Klonen zeigen. Allerdings führte das silencing der Metalloproteasen zu einer Reduktion der Zellrasenzerstörung. Die Transkriptome der Organoidzellen nach Kontakt mit Trophozoiten der Klone A1np und B2p, wiesen deutliche Unterschiede im Expressionsprofil auf. Trophozoiten des nicht-pathogenen Klons A1np scheinen die Immunantwort der Zellen stärker zu stimulieren als die des pathogenen Klons B2p. Dabei scheinen vor allem die Ausschüttung von Interleukin-10 und die Stimulation des Toll-like 4 Rezeptors eine tragende Rolle zu spielen. Weiter scheinen die Trophozoiten beider Klone die Homöostase der Organoidzellen zu beeinflussen, indem sie den Energiestoffwechsel, die Proteinbiosynthese und Prozesse der Zellentwicklung stören. In der Genexpression der Trophozoiten der Klone A1np und B2p zeigen sich ebenfalls deutliche Unterschiede nach Co-Inkubation mit den Organoidzellen. Der pathogene Klon B2p scheint dabei besser auf den oxidativen Stress zu reagieren, was einen Vorteil in der Immunabwehr mit sich bringt. Für beide Klone konnte ein Anstieg von Stoffwechselwegen des Energiehaushaltes gezeigt werden. Im Weiteren sollten im Rahman dieser Dissertation, neben dem oben beschriebenen Einfluss auf die Zellrasenzerstörung, die Bedeutung der Metalloproteasen EhMP8-1 und EhMP8-2 für die Pathogenität entschlüsselt werden. Dafür wurden Transfektanten, in denen die Genexpression entweder gesteigert oder gehemmt war, phänotypisch charakterisiert. Dabei war der zytopathische Effekt der silencer auf HepG2 Zellen signifikant geringer im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen. Auch führte das silencing zu einer signifikant geringeren Cysteinproteaseaktivität in den Transfektanten im Vergleich zum Wildtyp. Eine genauere Analyse zeigte, dass bei den silencern des nicht-pathogenen Klons A1np die Cysteinproteasen EhCP-A1 und EhCP-A2 betroffen sind, während bei dem silencer des pathogenen Klons B2p die beiden Cysteinproteasen EhCP-A5 und EhCP-A7 eine geringere Aktivität aufwiesen. Eine vergleichende Transkriptomanalyse der Transfektanten führte zur Identifizierung einer Vielzahl an differentiell exprimierten Genen. Dabei waren vor allem bei den silencern des nicht-pathogenen Klons A1np viele Gene aus der Familie der AIG1 Proteine ebenfalls signifikant runterreguliert. Die Funktion dieser Proteine ist in E. histolytica noch weitestgehend ungeklärt. Weiter konnten eine Reihe von Genen, die für die beiden Untereinheiten des Gal/GalNAc Lektin codieren, als ebenfalls signifikant runterreguliert identifiziert werden. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse der Co-Inkubationsexperimente von E. histolytica mit humanen, intestinalen Organoiden darauf hin, dass pathogene und nicht-pathogene Amöben zu einer unterschiedlichen Stimulation der intestinalen Zellen führen. Weiherhin wurde gezeigt, dass die Metalloproteasen EhMP8-1 und EhMP8-2 die Pathogenität von E. histolytica beeinflussen.