DC ElementWertSprache
dc.contributor.advisorPantel, Klaus-
dc.contributor.advisorReumann, Sigrun-
dc.contributor.authorKoch, Claudia-
dc.date.accessioned2022-10-13T12:09:51Z-
dc.date.available2022-10-13T12:09:51Z-
dc.date.issued2021-11-12-
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9857-
dc.description.abstractKlassische Gewebsbiopsien und bildgebende Verfahren (z.B. Radiologie) haben die Behandlung von Krebspatienten, sowie unser Verständnis der Karzinogenese, Metastasierung, des Ansprechens auf sowie der Resistenz gegenüber Therapeutika maßgeblich bestimmt. Innerhalb der letzten Jahre hat die Untersuchung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) als Form der nicht-invasiven Flüssigbiopsie zunehmend wissenschaftliches und klinisches Interesse geweckt. Die Enumeration zirkulierender Tumorzellen ist ein wertvoller prognostischer Marker für das Überleben von Krebspatienten, sowie ein Surrogatmarker für das Therapieansprechen in mehreren Krebsentitäten. Die molekulare Charakterisierung von CTCs hat unser Verständnis der intra-Tumor Heterogenität und deren Einfluss auf Therapieansprechen und Prognose zudem entscheidend erweitert. Die Forschung an CTCs eröffnet einen Weg in Richtung personalisierter Medizin für Krebspatienten. Eines der größten Hindernisse der CTC-Analyse ist die Seltenheit mit der diese Zellen in der Blutbahn vorliegen. Die Anzahl detektierbarer CTCs zu maximieren stellt daher weiterhin ein höchst relevantes Ziel dieses Forschungsfeldes dar. Innerhalb dieser Arbeit wurden weitreichende Anstrengungen unternommen um ein vielversprechendes, größenbasiertes CTC Anreicherungs-verfahren zu optimieren und analytisch zu validieren. Die Anzahl detektierter CTCs konnte erfolgreich um das 4,7-fache erhöht werden. Dies wurde im direkten Vergleich gepaarter Patientenproben metastatischer Brustkrebspatientinnen nachgewiesen. Es wurden zudem zwei robuste Protokolle entwickelt, welche die Detektion unfixierter (EDTA) sowie fixierter (TransFix®) Einzelzellen und sogenannter CTC-Cluster (CTC-Gruppen/Aggregate) ermöglichen. Die Leistungsfähigkeit dieser Protokolle wurde anhand einer gemischten Krebspatientenkohorte bestätigt. Des Weiteren wurde die Vereinbarkeit der entwickelten Protokolle mit gängigen molekularen Analyseverfahren, sowie mit einem semi-automatisierten Nachweisverfahren demonstriert. In einem weiteren Schritt wurde die untersuchte Anreicherungsmethode mit einem neuen, innovativen mikrofluidischen System verbunden, welches markierte CTC Populationen innerhalb einer mikrofluidischen Kammer immobilisiert. Durch Anpassung der Chip Struktur konnte eine fast vollständige CTC Anreicherungseffizient erreicht werden. Die angereicherten CTCs zeigten darüberhinaus einen hohen Anteil an Viabilität (>90%) und waren molekularen Analyseverfahren zugänglich. Um die intra- und inter-technologischen Abweichungen in der Leistungsfähigkeit ausgewählter CTC Anreicherungsverfahren zu prüfen, wurden in einem letzten Schritt internationale Ringstudien aufgesetzt. Fünf unterschiedliche Anreicherungsverfahren wurden in unterschiedlichen renomierten Laboren verglichen und auf die Effizient Ihrer Anreicherung EpCAMniedriger und EpCAMhoher Tumorzellinien geprüft. Die Studie wies große Unterschiede in der Anreicherungseffizient und Messungsvariabilität der untersuchten Methoden auf, welches die Relevanz multizentrischer technischer Vergleichsstudien unterstreicht. Die in dieser Studie etablierte internationale Plattform zur Beurteilung technischer Validität wird ihre Aktivität über das gegründete European Liquid Biopsy Society (ELBS) Konsortium weiterführen. Die Bildung von Fernmetastasen markiert den Übergang einer lokalen zu einer systemischen Krebserkrankung und wird von einem entschiedenden Abfall der Überlebenswahrscheinlichkeit begleitet. Trotz substanziellem Fortschritt im Bereich der Krebsforschung sind die zugrundeliegenden Mechanismen der Dissemination von Tumorzellen immer noch weitestgehend unbekannt. CTCs und funktionelle CTC-Modelle im speziellen, haben das Potential weitreichende Einblicke in die grundlegenden Bedingungen und Voraussetzungen der blutbasierten Streuung zu ermöglichen. In dieser Arbeit wird die Etablierung und weitreichende molekulare sowie funktionelle Charakterisierung einer neuen, permanenten Estrogenrezeptor-positiven (ER+) CTC Zelllinie (CTC-ITB-01) beschrieben. CTC-ITB-01 wurde aus der Blutprobe einer ER+, metastatischen Brustkrebspatientin gewonnen. Die hohe genetische Übereinstimmung zwischen CTC-ITB-01 und den zur Zeit der Blutentnahme vorliegenden CTCs der Patientin, weisen stark auf eine Abstammung der CTC-Zelllinie von einer Subpopulation dieser CTCs hin. CTC-ITB-01 vereint primär epitheliale Protein- und mRNA- Expressionsmuster mit der Expression von Krebsstammzell-assoziierten Proteinen, wie ALDH1 und NUMB. Die kanzerogene und metastatische Kapazität der CTC-Zellllinie wurde in Mausexperimenten bestätigt. Im Mausmodell zeigte sich ebenfalls, dass CTC-ITB-01 den metastatischen Tropismus ER positiven Brustkrebses wiederspiegelt und zur Effizienztestung neuer Therapeutika herangezogen werden könnte. Zusammenfassend stellt CTC-ITB-01 ein wertvolles funktionelles Model zur Untersuchung der biologischen Charakteristika zirkulierender Tumorzellen dar. Als Surrogat für Tumorgewebe können CTCs das Aufkommen resistenter Tumorzellklone sowie die Existenz innerter oder erworbener Resistenz gegenüber spezifischer Therapeutika anzeigen. Die zeitnahe Identifikation einer Therapieresistenz und die darauf angepasste Behandlung des Patienten kann entscheidend für den Verlauf der Erkrankung werden. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden entwickelt um die Transkription von ARV7 (Androgenrezeptor Splice-Variante 7), einem etablierten Biomarker für Resistenz gegenüber sekundärer Hormontherapie im Prostatakarzinom, nachzuweisen. Beide Methoden wurden umfassend technisch validiert und auf Ihre Übertragbarkeit auf klinische Patientenproben hin untersucht. (a) Basierend auf der CTC Anreicherung mittles des einzigen von der Amerikanischen Food and Drug Association (FDA) für das Prostatakarzinom zugelassenen Technologie (CellSearch®), wurde ein hochsensitiver qPCR Ansatz entwickelt um ARV7 und keratin-19 mRNA in CTCs zu detektieren. Mittels dieser Methode konnten ARV7 Transkripte aus einer einzelnen CTC, selbst nach 24 Stunden der Probenlagerung, nachgewiesen werden. Bei Blutproben mit ≥5 CTCs war ARV7 höchst robust und zuverlässig detektierbar. (b) Der in-situ Nachweis von ARV7, PSA, und AR-FL (vollständiger Androgenrezeptor) Transkripten, kombiniert mit der immunozytochemischen Färbung von Keratinen und CD45, ermöglicht wertvolle Einblicke in die Heterogenität der ARV7- und Keratin-expression innerhalb und zwischen Prostatakarzinompatienten. Die Methode erlaubt darüber hinaus eine absolute Quantifizierung von ARV7 Transkripten bei geichzeitiger Bewahrung der zellulären Integrität. Diese Nachweismethode ist mit einem breiten Spektrum an CTC Anreicherungsverfahren kombinierbar. Die größenabhängige CTC Anreicherung identifizierte eine ARV7-positive CTC Subpopulation mit niedriger Keratin Expression, welche höchstwahrscheinlich von anderen Marker-abhängigen Technologien nicht detektiert worden wäre. Zusammenfassend stellt diese Arbeit daher wertvolle Methoden, sowie neue Erkenntnisse der CTC Biologie, zur Verfügungum um offene Fragen hinsichtlich der biologischen und klinischen Relevanz von ARV7+ und Keratinniedrigen CTC Subpopulationen im Prostatakarzinom zu beantworten.de
dc.description.abstractTraditional tissue biopsies and classical imaging techniques (e.g. radiology) have dominated the field of cancer patient management and shaped our understanding of tumorigenesis, metastasis, treatment response, and therapy resistance. In recent years, the analysis of circulating tumor cells (CTCs) as a non-invasive liquid biopsy has gained momentum. CTC enumeration has become a valuable prognostic marker for patient survival as well as a surrogate biomarker to assess treatment response for multiple cancer entities. Molecular characterization of CTCs has furthermore broadened our understanding of intra-tumor heterogeneity and its effect on treatment response and prognosis. Collectively, CTC research has opened a path towards real-time personalized medicine for cancer patients. A major hurdle of CTC research is the rarity with which these cells can be found in the bloodstream. Improving CTC enumeration and detection therefore remain of paramount importance in the field. In this thesis, extensive efforts were made towards optimization and analytical validation of a promising label-independent CTC enrichment approach. CTC capture was increased 4.7-fold as demonstrated by direct comparison in paired breast cancer patient samples. Overall, two separate robust protocols allowing for the capture of un-fixed (EDTA) or preserved (TransFix®) single CTCs and CTC clusters were developed and their proficiency was corroborated on a mixed cancer patient collective. Also, compatibility with standard downstream molecular analysis and semi-automated sample evaluation were demonstrated. In a separate step, this enrichment technology was paired with a novel, innovative microfluidic device which immobilizes inoculated CTC populations within a microfluidic chamber. Near full CTC capture efficiency was achieved following improvement of the chip design. Also high retained cell viability (>90%) and compatibility with downstream molecular analysis approaches was shown. Finally, in an effort to assess intra- and inter-technology performance, multiple CTC enrichment platforms were compared across internationally renowned partner laboratories. Both label-dependent and label-independent technologies were assessed using well characterized EpCAM low and EpCAM high lung cancer cell lines. Vast differences in capture efficiency as well as performance variability were shown for the five different enrichment technologies tested, underlining the relevance of this multi-center technical benchmarking. The established international platform to assess technical validity will remain in operation via the European Liquid Biopsy Society (ELBS) consortium. The formation of distant metastasis marks the transition from localized to systemic disease for cancer patients and is accompanied by a significant decrease in patient survival. Despite substantial advances in the field of cancer research, the underlying mechanisms of blood-borne dissemination remain largely unknown. Circulating tumor cells (CTC), and especially functional CTC models, hold the potential to provide insight into the fundamental requirements of tumor cells within the process of haematogeneous spread. In this thesis, we describe the establishment and in-depth molecular and functional characterization of an estrogen-receptor positive (ER+) CTC-derived permanent cell line (CTC-ITB-01). CTC-ITB-01 was isolated from a metastatic ER+ breast cancer patient following the development of resistance towards endocrine therapy. High genetic concordance was demonstrated between the established cell line and the original CTCs present at time point of blood draw, strongly indicating CTC-ITB-01’s descent of from a subpopulations of these tumor cells. The CTC cell line was classified as epithelial-like and expresses stem cell markers such as ALDH1 and NUMB. In line with this, CTC-ITB-01 displayed tumorigenic and metastatic capacities in mice and adequately mirrored the metastatic tropism of ER+ breast cancer patients. Overall, CTC-ITB-01 represents a valuable new model to study CTC biology and allow for testing of drug efficacy in ER+ breast cancer. As a form of surrogate material for tumor tissue, CTCs can reflect the emergence of tumor cell clones resistant to specific drugs and support the identification of innate or acquired resistance. The timely detection and optimal management of such therapy resistance may save valuable time for the patient and stratify them for alternative therapeutic branches. In this thesis, two assays were developed to detect ARV7, an established biomarker for resistance towards secondary hormone therapy in prostate cancer. Both assays were thoroughly technically validated and demonstrated clinical feasibility with prostate cancer patient samples. (a) A highly sensitive and specific qPCR assay based on the only FDA-approved technology for enrichment of prostate cancer CTCs was developed for detection of ARV7 and keratin-19 mRNA. This assay showed sensitivity down to a single ARV7-positive cell even after 24h of sample storage and high level of robustness for samples containing ≥5 CTCs. (b) In situ detection of ARV7, PSA and AR-FL transcripts, combined with immunocytochemical staining of pan-keratin and CD45 protein levels provided valuable insight into inter-, and intra-patient heterogeneity of ARV7 and keratin expression in prostate cancer patient CTCs. Absolute quantification of ARV7 expression was possible while cellular integrity is maintained. This approach is combinable with various CTC enrichment platforms. Label-independent CTC enrichment resulted in the identification of keratin-low ARV7+ CTC populations that probably has undergone an epithelial-mesenchymal transition and would have surely been missed by label-dependent technologies. In summary, this thesis provides valuable tools and novel insights into CTC biology to answer pressing questions on the clinical and biological relevance of ARV7+, as well as keratin-low, CTC subpopulations in prostate cancer.en
dc.language.isoende_DE
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzkyde
dc.relation.haspartdoi:10.3390/cancers12020442de_DE
dc.relation.haspartdoi:10.1002/adbi.201900162de_DE
dc.relation.haspartdoi:10.1093/clinchem/hvaa322de_DE
dc.relation.haspartdoi:10.15252/emmm.201911908de_DE
dc.relation.haspartdoi:10.1373/clinchem.2017.281295de_DE
dc.relation.haspartdoi:10.3390/cells8091067de_DE
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2de_DE
dc.subjectZirkulierende Tumorzellende
dc.subjectLiquid Biopsyen
dc.subjectCTCen
dc.subjectCTC Cell Lineen
dc.subjectCirculating Tumor Cellen
dc.subject.ddc570: Biowissenschaften, Biologiede_DE
dc.titleMolecular and functional characterization of pathways relevant to metastasis and cancer therapy in circulating tumor cells of breast and prostate cancer patientsen
dc.typedoctoralThesisen
dcterms.dateAccepted2022-07-08-
dc.rights.cchttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/de_DE
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/-
dc.subject.gndKrebs <Medizin>de_DE
dc.subject.gndBrustkrebsde_DE
dc.subject.gndProstatakrebsde_DE
dc.subject.gndMolekularbiologiede_DE
dc.subject.gndMetastasede_DE
dc.subject.gndTherapiede_DE
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionde_DE
dc.type.thesisdoctoralThesisde_DE
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentBiologiede_DE
thesis.grantor.placeHamburg-
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburgde_DE
dcterms.DCMITypeText-
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-ediss-103709-
item.advisorGNDPantel, Klaus-
item.advisorGNDReumann, Sigrun-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1other-
item.fulltextWith Fulltext-
item.creatorOrcidKoch, Claudia-
item.creatorGNDKoch, Claudia-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
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