Interaktion zwischen dem CCAAT/Enhancer Binding Protein beta (C/EBP beta) und dem Tumorsuppressorprotein p53 : Funktion von p53 im humanen Endometrium

Abstract

In vielen Differenzierungsprozessen ist das CCAAT/enhancer binding Protein beta (C/EBP beta) von entscheidender Bedeutung. C/EBP beta ist ein Transkriptionsfaktor, der in zwei Protein-Isoformen existieren kann: einem transkriptionell aktiven Protein, LAP (liver-enriched activatory protein) und einem inhibitorischen Protein, LIP (liver-enriched inhibitory protein), dem die Transaktivierungsdomäne (TAD) fehlt. In früheren Studien unserer Arbeitsgruppe konnte eine erhöhte, cAMP-abhängige Expression von C/EBP beta in differenzierenden endometrialen Stromazellen (ESZ) nachgewiesen werden (Pohnke et al., 1999). Diese Differenzierung wird auch als Dezidualisierung bezeichnet und dient zur Vorbereitung des Endometriums auf die Einnistung (Implantation) des Embryos. Ein Charakteristikum von differenzierenden ESZ ist die Sekretion von Prolaktin, einem Markerprotein der Dezidualisierung. In vitro kann der Dezidualisierungsprozess durch Behandlung von ESZ mit Hormonen oder cAMP-Analoga induziert werden. Dies führt u.a. zu einer Hochregulierung von C/EBP beta und bewirkt eine anhaltende Aktivierung des dezidualen Prolaktin (dPRL)-Promotors (Pohnke et al., 1999). Da die Aktivierung des dPRL-Promotors strikt mit dem Dezidualisierungsprozess verknüpft ist, wird die Induktion dieses Promotors untersucht, um relevante Transkriptionsfaktoren im Differenzierungsprozess von ESZ zu identifizieren. Dabei wurde das Tumorsuppressorprotein p53 isoliert, das ebenfalls als ein Transkriptionsfaktor bekannt ist. In Abhängigkeit von genotoxischem Stress wird es aktiviert und reguliert die Expression von Proteinen, die in Prozessen des Zellzyklus, der DNA-Reparatur oder der Apoptose involviert sind.

In früheren Transfektionsstudien mit ESZ wurde gezeigt, dass p53 in der Lage ist, eine C/EBP beta-abhängige Aktivierung des dPRL-Promotors zu inhibieren (Pohnke et al., 2004). Eine Interaktion von C/EBP und p53 konnte in einem GST-Pulldown Assay in vitro nachgewiesen werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte einerseits eine Interaktion von C/EBP beta und p53 näher charakterisiert und andererseits eine Rolle von p53 im Dezidualisierungs-prozess von endometrialen Stromazellen (ESZ) untersucht werden.

Eine in vivo Interaktion von C/EBP beta und p53 konnte erstmals durch Koimmunpräzipitationen sowohl in transfizierten Saos-2-Zellen als auch in cAMP-behandelten ESZ nachgewiesen werden. Die Resultate deuten auf eine Vermittlung der Interaktion über die C-Termini von C/EBP beta und p53 hin. Eine gegenseitige Inhibierung der transkriptionellen Aktivität von C/EBP beta und p53 wurde in Transfektionsstudien mit Saos-2-Zellen beobachtet. Es zeigte sich, dass nicht nur p53 eine C/EBP beta-vermittelte Aktivierung eines C/EBP-responsives Reportergenkonstruktes inhibierte, sondern auch vice versa, dass eine p53-induzierte Transaktivierung eines p53-responsiven Reportergenkonstruktes durch beide C/EBP beta-Isoformen, LAP und LIP, reprimiert wurde. Eine Kompetition um den limitierenden Kofaktor p300/CBP konnte als zu Grunde liegender Mechanismus der gegenseitigen Transrepression ausgeschlossen werden. Eine mögliche Erklärung könnte eine deutliche Reduktion von C/EBP beta-Proteinspiegeln in Anwesenheit von transfiziertem p53 und eine Reduzierung des p53-Proteins durch überexprimiertes C/EBP beta sein. Diese gegenseitige Proteinreduktion konnte auch durch den Zusatz eines Proteasom-Inhibitors (MG-132) nicht aufgehoben werden. Vermutlich sind die C-terminalen Domänen beider Faktoren in diesem Prozess involviert. In EMSA (electrophoretic mobility shift assay)-Studien mit Kernextrakten aus Saos-2-Zellen, die endogenes C/EBP beta aufweisen, konnte eine schwache Reduzierung der DNA-Bindungsfähigkeit von C/EBP beta in Gegenwart von transfiziertem Wildtyp-p53 gezeigt werden. Weitere EMSA-Experimente bestätigten allerdings auch eine Reduktion der p53-DNA-Bindungsfähigkeit in Anwesenheit von exogenem C/EBP beta mit Kernextrakten aus COS-7-Zellen, die endogenes p53 besitzen. Im letzteren Fall zeigte sich darüber hinaus, dass in Gegenwart eines spezifischen C/EBP beta-Antikörpers die Bildung eines indirekten Supershifts zu beobachten war, was auf eine Interaktion von C/EBP beta mit DNA-gebundenem p53 hindeutet.

Des Weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals eine Korrelation zwischen einer erhöhten p53-Proteinexpression und dem cAMP-induzierten Dezidualisierungsprozess von ESZ nachgewiesen werden. In einem Zeitverlaufsexperiment wurde gezeigt, dass p53 dabei nicht akut, sondern erst innerhalb von 2 bis 4 Tagen im Kern akkumuliert und auch nach 12 Tagen noch erhöht ist. Zur Überprüfung einer Relevanz von p53 im Dezidualisierungsprozess ist es in dieser Arbeit erstmals gelungen, die RNA interference (RNAi)-Methode an humanen ESZ erfolgreich anzuwenden und das p53-Protein in cAMP-behandelten Zellen bis zu 6 Tagen herunterzuregulieren.