Untersuchung zur Aktivierung des Ionenkanals TRPM2 durch ADPR und ADPR-Derivate

Abstract

Bei TRPM2 handelt es sich um einen Kationenkanal, der permeabel für Natrium-, Kalium und Calciumionen ist. Der Kanal kann durch die Agonisten Adenosin-5′-diphosphoribose (ADPR) und 2′-Desoxy-ADPR geöffnet werden, wobei sich die Calciumionenkonzentration, die Temperatur und der pH-Wert auf das Öffnungsverhalten auswirken. Ob es sich auch bei cyclischer ADP-Ribose (cADPR) um einen TRPM2 Agonisten handelt, wird in der Literatur seit längerem kontrovers diskutiert. In den letzten Jahren konnte dank der Weiterentwicklung der Elektronenmikroskopie die Struktur verschiedener TRPM2-Orthologe aufgeklärt werden, ein wichtiger Schritt zum besseren Verständnis der Regulation des Kanals. Es wurde beobachtet, dass die NUDT9H-Domäne in TRPM2 aus der Seeanemone Nematostella vectensis zwar katalytische Aktivität aufweist und den Liganden hydrolytisch spaltet, aber nicht zur Aktivierung des Kanals erforderlich ist. Im Gegensatz dazu ist die NUDT9H Domäne in Wirbeltieren katalytisch inaktiv. Dies deutet darauf hin, dass es im Verlauf der Evolution zu Veränderungen in der Funktionsweise des Kanals gekommen ist. Die relativen Beiträge der strukturell unterschiedlichen Bindungsstellen für die Aktivierung des humanen Kanals sind noch nicht hinreichend geklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bedeutung der beiden Bindungsstellen für die Aktivierung des humanen Kanals näher untersucht, indem die Bindung von Nukleotiden durch Punktmutationen verhindert wurde. Dabei zeigte sich, dass die Inaktivierung jeweils einer Bindungsstelle dazu führt, dass der Kanal weder durch ADPR noch durch 2′-Desoxy-ADPR aktivierbar ist. Darüber hinaus wurde der Frage nachgegangen, ob es sich bei dem sekundären Botenstoff cADPR um einen TRPM2 Agonisten handelt. cADPR wird seit langem als möglicher Agonist für TRPM2 diskutiert und die Beobachtung, das ADPR in der MHR1/2 Domäne in einer Hufeisen-förmigen Konformation vorliegt, könnte darauf hindeuten das cADPR an die MHR1/2 Domäne zu binden vermag. In einigen Publikation konnte der durch cADPR induzierte Strom zudem durch den cADPR-Antagonisten 8-Br-cADPR unterdrückt werden. Mittels elektrophysiologischen Messungen an TRPM2 exprimierenden HEK-293 Zellen wurde die Wirkung von cADPR auf TRPM2 unter verschiedenen Bedingungen untersucht. In keiner der untersuchten Bedingungen führte die Infusion von cADPR zu einer Aktivierung des Kanals. Auch die Co-Infusion von cADPR zusammen mit einer ADPR Konzentration, die gerade noch keine Aktivierung des Kanals hervorruft, führte zu keiner Zunahme des Stroms in den Zellen. Ein in der Literatur beschriebener, synergistischer Effekt von cADPR und ADPR konnte dementsprechend nicht bestätigt werden. Um den Unterschied zwischen ADPR und cADPR noch besser herauszuarbeiten, wurde zudem mit IDPR und N1-cIDPR gearbeitet. Bei N1-cIDPR handelt es sich im Vergleich zu cADPR um ein hydrolyse-stabileres Molekül. Als cADPR analoges Molekül kann es Calciumionen freisetzen. Auch IDPR wurde bereits zuvor als TRPM2 Agonist beschrieben, jedoch konnte mit kommerziell erhältlichem IDPR kein TRPM2-Strom beobachtet werden. Auch durch N1-cIDPR ließ sich hTRPM2 nicht aktivieren. Um die Aktivierung von TRPM2 in Zellen mittels Imaging zu untersuchen wurde ein Reportersystem etabliert, bei dem ein genetisch-codierter Ca2+-Indikator für optisches Imaging (GECO) durch einen Intrabody an den Kanal gebunden wurde. TRPM2 wurde dafür mit einem nicht natürlich vorkommenden Epitop (ALFA-tag) exprimiert. Der bidirektionale Expressionsvektor enthielt zudem die codierende Sequenz für ein Fusionsprotein aus dem α-ALFA-Intrabody und dem genetisch encodierten Ca2+-Indikator (GECO). Dieser Vektor wurde in HEK-293-Zellen exprimiert und die Funktion des Systems elektrophysiologisch und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Elektrophysiologisch zeigte sich, dass die Fusion des ALFA-tags an den N-Terminus von TRPM2 die Aktivierung durch ADPR nicht beeinträchtigt. In einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop konnte eine Zunahme der GECO-Fluoreszenz nach Infusion von ADPR über die Patch-Pipette beobachtet und somit die Eignung des Konstrukts als Reportersystem demonstriert werden.