1          Einleitung

 

1.1      Eisenstoffwechsel

 

Die Gesamtmenge des Eisens im menschlichen Organismus beträgt 3-5 g. Diese setzt sich zusammen aus Funktions-, Transport- und Depoteisen.

Der weitaus größte Anteil des Eisens von ca. 70-90% befindet sich in den roten Blutkörperchen. Darüber hinaus ist Eisen für einige andere Häm und Nicht-Häm Proteine von essentieller Bedeutung. Dazu zählen das sauerstoffspeichernde Myoglobin der Muskelzellen, die Cytochrome als Enzyme der Atmungskette sowie weitere Enzyme mit Redoxaktivität wie z.B. die Ribonukleotidreduktase.

Das Depoteisen, welches etwa 10-30% der Gesamteisenmenge ausmacht, befindet sich hauptsächlich in der Leber, aber auch in der Milz, im Knochenmark und den Muskeln und ist an Ferritin und Hämosiderin gebunden.

Das Transporteisen stellt mit ca. 3 mg den geringsten Anteil des Eisens im menschlichen Organismus dar und zirkuliert an Transferrin gebunden im Kreislauf. Mit einem täglichen Umsatz der 10 fachen Menge ihres eigenen Bestandes stellt es die Drehscheibe des Eisenstoffwechsels im Organismus dar.

 

 

Toxizität des Eisens

Eisen in freier Form ist toxisch. Dies ist auf seine Fähigkeit  zurückzuführen, die Bildung von sehr reaktiven Sauerstoffradikalen wie Superoxiden, Peroxiden und Hydroxylen anzuregen (Haber und Weiß 1934). Sauerstoffradikale führen zu Schäden an der DNA und den Lipiden der inneren und äußeren Membranen der Zelle, was mit dem Begriff "oxidativer Streß" umschrieben wird. Im menschlichen Organismus liegt nahezu kein freies Eisen vor. Proteine des Eisentransportes und der Eisenspeicherung schützen vor dem oxidativen Streß und gewährleisten eine ausreichende  Löslichkeit sowie Bioverfügbarkeit des Eisens im Organismus.

 

 

Homöostase des Eisens

Die Homöostase des Eisens wird nur über die Regulierung der enteralen Eisenabsorbtion hauptsächlich an den Mukosazellen des Duodenums aufrechterhalten (Conrad et al. 1987). Sie ist beim Eisenmangel gesteigert und bei gefüllten Eisenreserven erniedrigt. Ein regulierbarer Ausscheidungsmechanismus existiert nicht. Die Aufnahme des Eisens in die Mukosazelle sowie die Abgabe in den Portalvenenkreislauf stellen die Schlüsselpositionen der Aufnahmeregulation dar (Nathanson und Mc Laren 1987; Wheby und Spyker 1981). Die molekulare Basis dieser Prozesse ist bislang nicht bekannt.

 

 

Eisenaufnahme in die Zelle

Die Aufnahme des Eisens in die Zellen ist davon abhängig, in welcher Form das Eisen im Plasma zirkuliert. Transferrin ist unter physiologischen Umständen die wichtigste Form, in der das Eisen vorliegt. Es gibt aber auch andere Proteine und Chelatoren, die Eisen im Plasma binden und transportieren können wie Ferritin, Haptoglobin, Hämopexin, Albumin, Laktoferrin und Chelatoren mit geringem Molekulargewicht wie z.B. Citrat. Sie gewinnen in bestimmten Situationen wie Schwangerschaft, intravasaler Hämolyse, Hämochromatose oder anderen Lebererkrankungen an Bedeutung.

Zum genauen Aufnahmemechanismus des Eisens in die Zelle siehe Kap. 1.4.3.

 

 

 

1.2      Eisenstoffwechsellstörungen

 

Prinzipiell lassen sich alle Störungen des Eisenstoffwechsels auf ein Mißverhältnis zwischen dem Bedarf und der Aufnahme von Eisen zurückführen. Die Störungen des Eisenstoffwechsels basieren entweder auf einem Mangel oder einem Überschuß an Eisen.

 

 

 

1.2.1   Eisenmangel

 

Weltweit betrachtet ist der Eisenmangel die häufigste Mangelkrankheit des Menschen. Nach Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) leiden gegenwärtig 500 Millionen Menschen an einer Eisenmangelanämie, der Folge chronischen Eisenmangels. Vom Eisenmangel sind hauptsächlich Säuglinge, Kleinkinder, Jugendliche im Wachstumsalter, Frauen in gebärfähigem Alter und Schwangere betroffen. Ätiologisch kommt hauptsächlich eine inadäquate Nahrungsversorgung bei erhöhtem physiologischem Bedarf durch Wachstum, Menstruation und Schwangerschaft in Betracht. Darüber hinaus können krankheitsbedingte Blutverluste (okkult, chronisch), aber auch iatrogen induzierte Blutverluste (Blutspenden, Hämodialyse, medikamentös induzierte Blutverluste) sowie auch ein Malabsorbtions-Syndrom (sehr selten) Eisenmangel und als Folge dessen eine Eisenmangelanämie bewirken.

 

 

 

1.2.2   Eisenüberladung

 

Als Eisenüberladung (Hämochromatose) wird jede Zunahme des Gesamtkörpereisens auf über 3-5 g bezeichnet. Hämochromatosen werden in zwei Gruppen, primäre  und sekundäre Hämochromatosen, eingeteilt.

 

 

Primäre Hämochromatose

Die primäre Hämochromatose (Synonyme: Hereditäre Hämochromatose; idiopathische Hämochromatose) ist eine angeborene Krankheit des Eisenstoffwechsels mit einer gesteigerten intestinalen Eisenabsorbtion über den normalen Bedarf hinaus.Dies hat eine Kumulation des überschüssigen Eisens im Organismus zur Folge.

 

Mit einer Prävalenz von 1:300 bis 1:400 für homozygote und 1:10 bis 1:20 für heterozygote Genträger gehört sie zu den häufigsten Stoffwechselkrankheiten des Menschen (Cox und Lord 1989). Allerdings erkranken von den homozygoten  Genträgern dieser Krankheit weniger als 10% manifest an der Hämochromatose. Hierfür werden Faktoren verantwortlich gemacht, welche die Eisenaufnahme vermindern bzw. den Eisenverlust erhöhen, wie z.B. der Konsum von Alkohol, geringer Eisengehalt der Nahrung, okkulte Blutverluste sowie die Regelblutung der Frau. Letzteres wird auch als Grund dafür angesehen, daß Frauen 5 bis 10 mal seltener erkranken.

 

Der Genort für das Hämochromatose-Gen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosom 6. Das wahrscheinlich für die Ausbildung der Hämochromatose verantwortliche Gen HFE (früher HLA-H genannt) konnte erst kürzlich nach langer Suche durch Feder et al. identifiziert werden (Feder et al. 1996). Das HFE Genprodukt, ein MHC-Klasse-I-Protein ist dem Antigen-Präsentierenden HLA-A-Protein sehr ähnlich. Dieses HFE-Protein bindet normalerweise das 2-Mikroglobulin (Feder et al. 1996). Eine Punktmutation an Position 845 mit Transition von Guanin zu Adenin hat bei den Hämochromatosepatienten zur Folge, daß 2-Mikroglobulin nicht mehr gebunden werden kann (Feder et al. 1997). Die Rolle, die das mutierte HFE-Gen bei der fehlregulierten intestinalen Eisenabsorbtion spielt, ist allerdings noch unklar.

 

Es gibt keine charakteristischen Frühsymptome der Hämochromatose. Die Beschwerden sind eher unspezifisch und werden meist in späteren Phasen der Diagnostik der richtigen Krankheit zugeordnet. Die häufigsten Symtome sind: Schwäche, Abgeschlagenheit, Potenz- und Libidominderung, Oberbauchbeschwerden und Arthralgien. Mit der Zunahme des Eisens im Körper und dem Fortschreiten der Krankheit nehmen auch die pathologischen Veränderungen im Organismus an Umfang und Schwere zu. Die häufigsten Befunde sind Leberzirrhose, gesteigerte Hautpigmentierung, Hepatomegalie, Diabetes mellitus, Hodenatrophie und Kardiomyopathie.

 

Die Therapie der primären Hämochromatose gelingt durch regelmäßige und häufige Aderlässe, wodurch die exzessiven Eisenmengen nach und nach aus dem Körper entfernt werden (Davies und Arrowsmith 1950). Diese Form der Therapie, die erstmals 1950 angewandt wurde, ist relativ einfach und dabei sehr effektiv. Die Prognose der Erkrankung hängt vom frühzeitigen Einsetzen der Therapie ab. Die konsequente Aderlaßtherapie bei Patienten, die bis Therapiebeginn keine Leberzirrhose entwickelt haben, führt zu der gleichen Lebenserwartung wie in der Normalbevölkerung (Niederau et al. 1985).

 

 

Sekundäre Hämochromatosen

Alle Formen der Hämochromatose, deren Ursache nicht in einem genetischen Defekt des Eisenstoffwechsels liegt, werden zu den sekundären (erworbenen) Hämochromatosen gezählt.

Da sehr unterschiedliche Ursachen zu der Steigerung des Körpereisenbestandes führen können, stellen die sekundären Hämochromatosen eine inhomogene Gruppe von Erkrankungen dar. Mögliche Ursachen einer sekundären Hämochromatose sind:

 

*  Chronisch refraktäre Anämien (z.B. Thalassämia major, sideroblastische Anämie, aplastische Anämie, renale Anämie),

*  chronische Lebererkrankungen (alkoholbedingte Lebererkrankung, porto-cavaler Shunt),

*  iatrogene Eisenzufuhr (Eisen oral/ parenteral, Bluttransfusionen, Hämodialyse),

*  alimentäre Eisenüberladung (z.B. Bantu-Siderose)

*  und kongenitale Störungen (Porpyhria cutanea tarda, kongenitale Atransferrinämie, kongenitale dyserythropoetische Anämien).

 

Unter den aufgeführten Ursachen der erworbenen Hämochromatosen bildet die Thalassämia major die größte Gruppe. Die Bantu-Siderose ist auf Süd-Afrika beschränkt und relativ selten. Hierbei führt der Genuß eines eisen- und alkoholhaltigen Getränkes bei den Erkrankten, die vermutlich heterozygote Genträger der primären Hämochromatose sind, zur Hämochromatose.

Bei ausreichend hohen Eisenkonzentrationen im Körper (> 10-15 g) finden sich die für eine Hämochromatose typischen Befunde Hepatomegalie, Hyperpigmentierung der Haut, Endokrinopathien, dilatative Kardiomyopathie, Diabetes mellitus (insulinpflichtig) sowie Impotenz und degenerative Arthropathien bei den Betroffenen in unterschiedlicher Häufigkeit sowie Konstellation wieder.

Die Therapie der Wahl bei sekundären Hämochromatosen ist die parenterale Gabe von Chelatbildnern. Hierfür werden hauptsächlich DFO sowie DTPA als Dauerinfusion über 12 h (nachts) intravenös oder subkutan eingesetzt.

Die Prognose einer sekundären Hämochromatose wird durch die Grunderkrankung, den Grad der Eisenüberladung sowie die Therapiecompliance des Patienten bestimmt. Die konstante Therapie mit Chelatoren führt zu einer Verlängerung der Lebenserwartung und kann schwere Organschäden verhindern.

 

 

 

1.2.3   Mechanismus der Eisenschädigung

 

Daß bei allen Formen der Eisenüberladung die stark erhöhten Eisenmengen im Organismus die Ursache der Schädigung der Gewebe darstellen, konnte durch viele Studien belegt werden. Durch tierexperimentelle Versuche und in-vitro-Versuche wurden viele Informationen zur Pathophysiologie der Eisenschädigung gewonnen. Damit läßt sich der genaue Mechanismus der Eisenschädigung gut erklären. Ob dies den Tatsachen in-vivo entspricht bleibt allerdings spekulativ.

 

Die bekannte eiseninduzierte peroxidative Schädigung mehrfach ungesättigter Fettsäuren der Membranphospholipide bildet möglicherweise die gemeinsame Grundlage der unterschiedlichen zellulären und subzellulären Schädigungen bei der chronischen Eisenüberladung (Bacon und Britton 1989; 1990) ( Abb. 1).

 

In Leberbiopsien von Patienten mit primärer Hämochromatose wurde eine funktionelle Hypertrophie der Lysosomen mit erhöhter Aktivität lysosomaler Enzyme und gesteigerter Fragilität der Lysosomen beobachtet (Seymour und Peters 1978). In einer Reihe von in-vitro Versuchen konnten funktionelle sowie strukturelle Veränderungen an Lysosomen, Mitochondrien und Mikrosomen festgestellt werden. Untersuchungen subzellulärer Bestandteile der Hepatozyten von  Tieren mit Carbonyleisenüberladung zeigten Veränderungen an Lysosomen, Mitochondrien, endoplasmatischem Retikulum, Plasmamembran und dem Zellkern. Es wurde auch eine insgesamt erhöhte Kollagensynthese und ein verändertes Sekretionsmuster der Lipozyten ( Ito-Zellen, Fett-Speicher-Zellen) beobachtet (Friedmann 1990).

Abbildung 1:           Mechanismus der Zellschädigung durch Eisen

 

 

Es wird angenommen, daß die multiplen Funktionsstörungen der subzellulären Organellen letztlich die Schädigung und den Untergang der Zellen herbeiführen. In der Leber bilden der Untergang der Parenchymzellen und die gesteigerte Kollagensynthese der Lipocyten die Grundlage der Fibrose und Zirrhose.

 

 

 

1.3      Tiermodelle

 

In der Tierwelt ist ein der primären Hämochromatose entsprechendes Krankheitsbild nicht bekannt. Daher hat man versucht, dieses Krankheitsbild experimentell zu imitieren. In der Absicht, die molekularen Mechanismen der Eisenüberladung sowie der Gewebsschädigung durch Eisen zu verstehen, entstanden einige verwertbare experimentelle Modelle. Dabei kommt bei den in-vivo Versuchen der Applikationsform der Eisenpräparate hinsichtlich der histologischen Verteilung z.B. in der Leber eine wichtige Rolle zu.

 

 

Parenterale Applikation

Eine Reihe von Eisenchelaten, wie z.B. einige Eisen-Kohlenhydratkomplexe (Fe-Dextran, Fe-Sorbitol, u.a.) oder Fe-Nitrilotriessigsäure (Fe-NTA), wurden bisher zur experimentellen Eisenüberladung von Versuchstieren verwendet. Das Ziel dieser Versuche war die Entwicklung eines experimentellen Tiermodells zur Erforschung der primären Hämochromatose. Bei der i.v.- oder i.m.- Applikation von Eisen-Kohlenhydratkomplexen zeigte sich initial eine bevorzugte Ablagerung des Eisens in das RES und erst zu späteren Zeitpunkten auch in Hepatozyten. Bei der i.p. Applikation von Fe-NTA fand sich das Eisen sowohl im RES als auch in den Hepatozyten. Das typische histologische Bild bei der primären Hämochromatose mit initial bevorzugter Eisenablagerung in den Hepatozyten ist hiervon abweichend. Die parenterale Applikation von Eisenchelaten hat bisher zu keinem geeigneten tierexperimentellen Modell für dieses Krankheitsbild geführt.

 

Orale Applikation von Eisen

Neben der parenteralen Gabe von Eisenpräparaten für experimentelle Zwecke hat sich natürlich die Eisenzufuhr auf dem physiologischen Weg per os angeboten.

Anfänglich wurden hierfür bestimmte Eisensalze eingesetzt. Die chronische Fütterung von Diäten, die mit Fe-Salzen angereicherten wurden, führte aber zu keiner nennenswerten Eisenanreicherung in der Leber (Richter 1984). Verantwortlich hierfür scheint die Herunterregulation der intestinalen Eisenabsorbtion bereits bei nur geringer Eisenüberladung zu sein.

Carbonyleisen stellt eine extrem reine Form von feindispersem elementarem Eisen dar (Partikelgröße < 4µm; Reinheit > 98% ).  Mit Carbonyleisen angereicherte Diäten wurden erstmals von Bacon et al. (1983; 1986) und später von anderen Arbeitsgruppen verwendet (Park et al. 1987; Iancu et al. 1987). Dabei wurden Lebereisenkonzentrationen von 6-10 mg Fe/ g mit initial periportaler Eisenablagerung vorzugsweise in Hepatozyten (ähnlich dem Bild der primären Hämochromatose) beschrieben. Nach einer Fütterungsdauer von 8 Monaten entwickelte sich eine Fibrose und leichte Zirrhose der Leber (Park et al. 1987). Pietrangelo konnte sogar nach nur zweimonatiger Fütterungsdauer histologisch eine septale Fibrose und erhöhte Mengen an Prokollagen I-mRNA in der Leber nachweisen (Pietrangelo et al. 1990). Diese vielversprechenden Ergebnisse der oralen Gabe von Carbonyleisen hinsichtlich der Entwicklung eines Tiermodells für die primäre Hämochromatose wurden durch die Tatsache relativiert, daß auch hier letztlich die Eisenaufnahme limitiert war. Die Verlängerung der Fütterungsdauer führte zu keinem nenenswerten Anstieg der Lebereisenwerte (Iancu et al. 1987; Ward et al. 1991b). Auch konnte bei der Carbonyleisenüberladung Hämosiderin, das wichtigste Eisenspeicherprotein der Leber bei der primären Hämochromatose, nicht isoliert werden (St. Pierre et al. 1988).

 

Bei der Entwicklung eines experimentellen Tiermodells für die primäre Hämochromatose wurden in die Ferrozene große Hoffnungen gesetzt. Ferrozen (Dicyclopentadienyleisen) und seine Derivate stellen eine Gruppe von ungewöhnlichen organischen Eisenverbindungen dar (Kealy und Pauson 1951; Miller et al. 1952). Aufgrund der limitierten intestinalen Absorbtion von ionischem Eisen beim Menschen erregten die Ferrozene zuerst als potentielle Eisenpräparate zur Behandlung der Eisenmangelanämie besonderes Aufsehen. Es zeigte sich, daß einige Ferrozene bei oraler Verabreichung gut aufgenommen wurden und nach ihrer Metabolisierung ihr Eisen für die Hämoglobinsynthese zur Verfügung stand (Golberg und Martin 1964; Madinaveitia 1965; Edwards et al. 1974). Allerdings stellte sich bald heraus, daß die chronische Fütterung dieser Präparate an Versuchstiere zur Hämosiderose der Leber führte (Kief et al. 1977; Yaery 1969). Dieser unerwünschte Effekt der Ferrozene führte zu ihrer Aufgabe als pharmakologische Testsubstanz zur Behandlung von Eisenmangelanämien.

Daß Ferrozen und seine Derivate möglicherweise geeignete Substanzen zur Entwicklung eines Tiermodells für die Hämochromatose darstellen könnten, wurde erstmals 1986 von Longueville und Crichton aufgegriffen. Sie konnten zeigen, daß schon eine vierzehntägige Fütterung von (3,5,5-trimethyhexanoyl)Ferrozen (TMH-Ferrozen) an Ratten zu einer schweren Eisenüberladung der Leber mit bevorzugt periportalem und hepatozellulärem Verteilungsmuster führt (Longueville und Crichton 1986). Untersuchungen zur subzellulären Verteilung ergaben erhöhte Eisenkonzentrationen in den Lysosomen mit leicht-fragilen Lysosomenmembranen (Ward et al. 1991a). Langzeitstudien mit der Fütterung von TMH-Ferrozen-haltigen Diäten bis zu 56 Wochen zeigten eine perisinusoidale und periportale Fibrose der Leber (Düllmann et al. 1992). Das Endstadium der Eisenüberladung, die Leberzirrhose, konnte allerdings nicht beobachtet werden. Am Herzen von Ratten, die über 76 Wochen mit TMH-Ferrozen gefüttert wurden, erfolgte die Ablagerung des Eisens vorzugsweise in den Makrophagen statt, wie bei der Eisenüberladung des Menschen, in den Myozyten (Braumann et al. 1994). Es ergaben sich im Vergleich zu der primären Hämochromatose auch Unterschiede hinsichtlich biochemischer Parameter wie des "Low-molecular-weight-iron" im Serum, des "Low-molecular-weight-iron" in den Zellen und des Serum-Ferritins (Nielsen et al. 1993b). Diese Abweichungen zu den Befunden beim Menschen und das Ausbleiben von typischen Organschäden wie z.B. Leberzirrhose und Diabetes mellitus führte letzlich zu der Überzeugung, daß die chronische Fütterung der Ferrozenderivate zur Erzeugung eines Tiermodells für die primäre Hämochromatose nicht geeignet sind, aber im Vergleich zu anderen Eisenverbindungen wie Fe-Sulfat und Carbonyleisen die effektiveren Substanzen für eine experimentelle Eisenüberladung darstellen (Nielsen et al. 1993c).

 

 

Die primäre Zellkultur

Seit die enzymatische Trennung von normalerweise im Gewebeverband lebenden Zellen möglich ist, werden für die Untersuchung vieler Fragestellungen, auch der des Eisenstoffwechsells, Zellkulturen verwendet. Hierbei unterscheidet man die primäre Zellkultur, die permanente Zellkultur sowie die maligne transformierten Zellen.

Frisch gewonnene Zellen eines Gewebes, die nach besonderen Methoden kultiviert werden, werden als primäre Zellkultur bezeichnet. Eine primäre Zellkultur, deren Fähigkeit zur unbegrenzten Teilung auf natürlichem oder experimentellem Wege erhalten bleibt, stellt eine permanente Zellinie dar. Bei maligne transformierten Zellen handelt es sich um Zellen, welche die Eigenschaften von Tumorzellen besitzen. Im Gegensatz zu der primären und permanenten Zellkultur, die eine spezielle Haftfläche zur Ausbildung eines Zellrasens benötigen, um längerfristig überleben zu können (einige Tage bis mehrere Wochen), schaffen es die maligne transformierten Zellen, als Suspensionskultur zu überleben. Zellen einer primären Zellkultur als Zellsuspension sind zeitlich begrenzt über mehrere Stunden in der Lage, ihre Funktionen und Integrität aufrechtzuerhalten.

 

Bei Untersuchungen, die nur einer kurzen Inkubationsdauer bedürfen, wie im Rahmen dieser Arbeit, bietet sich die primäre Suspensionskultur hinsichtlich Praktikabilität und Ökonomie an. Die Durchführung dieser Arbeit orientierte sich an einer durch Scheiber und Goldenberg (1996) modifizierten Methodik der Versuchsdurchführung. (siehe Kap. 2.3 und 2.4)

 

 

 

1.4      Stoffaufnahme in die Zelle

 

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des genauen Aufnahmemechanismus der Ferrozene in die Hepatozyten. In diesem Zusammenhang ist es sinnvoll, einen Überblick über die bekannten Zugangswege für Stoffe in die Zelle, die dafür notwendigen Strukturen und die Eigenschaften dieser Strukturen zu bekommen.

 

 

 

1.4.1   Eigenschaften der Plasmamembran

 

Plasmamembranen kommen in allen Zellen vor. Sie markieren die Grenze zwischen dem "Innen" und "Außen" von Zellen und gewährleisten ihre morphologische und funktionelle Integrität. Das Zusammenspiel von Abgrenzung und Stoffaustausch ist ein komplexer und hochentwickelter Vorgang an der Plasmamembran. Abgrenzung äußert sich darin, daß für viele lebenswichtige Bestandteile der Zellen die Permeabilität durch die Plasmamembran nach außen äußerst gering ist. Andererseits wird der Stoffaustausch der Zelle in beide Richtungen durch eine Vielzahl spezifischer Transportprozesse reguliert. Spezifische Aufnahmeprozesse können an der äußeren Plasmamembran stattfinden oder nach rezeptorvermittelter Endozytose in das Zellinnere verlagert werden. Die entstehenden Vesikel sind Orte intensiven Stoffwechsels, wobei zusätzlich Prozesse des Stofftransportes durch die Vesikelwand erfolgen.

 

Zum Verständnis der transmembranalen Aufnahmeprozesse ist es wichtig, die Morphologie und Dynamik von Membranen zu kennen. Ein Membranmodell, das viele der bisher bekannten Eigenschaften von Membranen gut erklärt, ist das von Singer und Nicholson 1972 entwickelte "Fluid-Mosaic-Modell". Demnach bestehen Membranen aus einer Lipiddoppeltschicht (bilayer), in der die einzelnen Moleküle in der Membranebene beweglich sind. Elektronenmikroskopisch stellt sich diese Lipiddoppeltschicht als dreischichtiges Gebilde von ca. 10 nm Dicke dar. Die Lipide haben einen hydrophilen und einen hydrophoben (lipophilen) Molekülanteil. Die hydrophoben Anteile in beiden Lipidschichten sind einander zugewandt, so daß die hydrophilen Enden der Moleküle der wässrigen Umgebung zugewandt sind. Die Zusammensetzung der Lipide ist in beiden Lipidschichten unterschiedlich und differiert je nach Zelltyp. In diese Lipoidgrundmatrix eingelagert sind weitere Bestandteile der Membran wie globuläre Proteine (Enzyme, Transportproteine, Proteine der Signaltransduktion u.a.), Sterole, Glykoproteide und  anorganische Salze ( Abb. 2).

 

 


Lipid-Doppelmembran

 

Proteinmolekül

 

Abbildung 2:           `Fluid-Mosaik-Modell` der Membran nach Singer und Nicolson

 

Die Lagebeziehung der Membranproteine zur Membran ist nicht einheitlich. Die Proteine können in der Membran verankert sein, diese durchziehen oder aber ihr nur aufgelagert sein. Sie sind dabei nicht starr fixiert sondern, wie auch andere Bestandteile der Membran, in der Membranebene frei beweglich.

Es ist heute allgemein akzeptiert, daß für den Transport hydrophiler Stoffe durch Lipidmembranen besondere Funktionselemente in Form von Transportproteinen, Kanalbildnern usw. vorhanden sein müssen. Allerding ist noch immer weitgehend unklar, wie der Transport lipohiler Stoffe in Lipidstrukturen bzw. der transmembranale Transport solcher Stoffe stattfindet. Von großer Bedeutung hierbei scheinen die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Lipide und ihre Wechselwirkungen mit anderen Bausteinen der Membranen zu sein.

 

 

Membranlipide und ihre Eigenschaften

Lipide zeigen einen thermotropen, lyotropen, ionotropen und barotropen Polymorphismus, der sich in einer Reihe von Zustandsänderungen ausdrückt. Wichtig ist der Übergang lamellarer Strukturen vom flüssig-kristallinen (fluiden) Zustand(a) in den kristallinen (gelartigen) Zustand (b). Diese Umwandlung ist mit dem Schmelzen bzw. Erstarren der Parafinketten verbunden. Dabei ist sie von der Kettenlänge abhängig. So können durch die Zusammensetzung von Membranen mit Lipiden unterschiedlicher Umwandlungstemperatur und nach Ausbildung von sogenannten "Lipid-Domänen" (Bereiche einheitlicher Zusammensetzung) bedeutende Verhaltensänderungen der Membranen beobachtet werden. An der Grenze von fluiden und kristallinen Zonen tritt offenbar eine größere Zahl von Defekten in der Molekülordnung auf, was zu einer erhöhten Permeabilität für kleinere Moleküle führen kann. Die Ausbildung sogenanter Knicks, die sich sehr schnell in der Kettenlängsachse der Fettsäuren bewegen und eine Steigerung der Membranpermeabilität bedeuten, wurden beim Übergang von dem b in den a Zustand in sechsfach erhöhter Anzahl beobachtet. Auch die Lagebeziehung der einzelnen Membranmoleküle zueinander ist einer enormen Dynamik unterworfen. Dies veranschaulicht die Tatsache, daß die laterale Verschiebung des Lipidmoleküls in einer fluiden Phospholipidmembran um eine Strecke, die seinem eigenen Durchmesser entspricht, in etwa 10-7 Sekunden erfolgt (Bielka 1985).

Es gibt sogar poikilotherme Organismen, die zu einer viskotropen Regulation befähigt sind. Diese sind in der Lage, bei veränderten Bedingungen offenbar durch komplette oder sogar nur teilweise Neusynthese von Lipidmolekülen die Fluidität der Membran zu optimieren.

 

Solche Erkenntnisse der Biomembranforschung sind beeindruckend und deuten die Komplexität der Membran mit den ihr eigenen Funktionen an.

 

 

 

1.4.2   Transmembranäre Transportprozesse

 

Transportprozesse an der Plasmamembran lassen sich in passive und aktive Transportprozesse einteilen. Innerhalb dieser Gruppen lassen sich wiederum nach unterschiedlichen Kriterien Untergruppen aufstellen.

 

 

 

1.4.2.1            Passiver Transport

 

Passiver Transport ist dadurch gekennzeichnet, daß die Triebkraft für den Transport auf der Verteilung des transportierten Stoffes selbst in Form einer transmembranalen Differenz seines chemischen (ungeladene Moleküle) oder elektrochemischen Potentials (geladene Moleküle) beruht. Es läßt sich dabei eine unspezifische Diffusion (Permeation) von einem vermittelten Transport durch die Membran unterscheiden.

 

Worauf die Diffusion bzw. Permeation einzelner Stoffe durch Membranen beruht, ist bezüglich seiner molekularen Mechanismen noch unzureichend bekannt. Die Regel, daß beim Vergleich von geeignet ausgewählten Stoffen eine Parallelität von Permeationsvermögen und Lipohilie besteht, deutet auf die Rolle der Lipiddoppelmembran hin. Daneben sind es Membranproteine und Grenzzonen zwischen ihnen und den Lipiden, oder die Randzonen von Lipiddomänen, die als unspezifische "Lecks" auftreten können (Bielka 1985). Die quantitativen Zusammenhänge beschreibt das 1.Ficksche Diffusionsgestz. Es besagt, daß die pro Zeiteinheit durch eine Membran diffundierende Stoffmenge Q proportional dem Diffusionskoeffizienten D, der Austauschfläche F und der Konzentrationsdiffernz DC und umgekehrt proportional der Diffusionsstrecke l ist:

 

dQ/ dt = (D*F/l)* DC [mol/s]                        (1)

 

Bei der Diffusion durch biologische Membranen enthält D die allgemeine Gaskonstante (R), die absolute Temperatur (T), den Radius des diffundierenden Moleküls (r), die Viskosität der Membran (h) und den Öl-Wasser-Verteilungskoeffizienten (k), ein Maß für die Lipoidlöslichkeit des diffundierenden Moleküls in der Phospholipidmembran.

 

D = R*T k/(6p*h*r) [m2*s-1]                           (2)

 

Da die Membrandicke als konstant angesehen werden kann, wird statt D/l oft der Permeabilitätskoeffizient (P) verwendet. Wenn man die Transportrate Q/t auf die Fläche F bezieht, ergibt sich folgende Gleichung:

 

dQ/(dt*F) = p*DC[mol*m2*s-1]                       (3)

 

Die pro Fläche und Zeit (netto-)diffundierende Stoffmenge [mol*m2*s-1] ist damit der Konzentrationsdifferenz (DC hier in mol/m3 Lösungsmittel) und dem Permeabilitätskoeffizienten(P, in m/s) proportional.

 

Die erleichterte Diffusion wird im Gegensatz zur einfachen Permeation durch spezifische und sättigbare Strukturen wie Transportproteine ("Carrier"), Austauschsysteme ("Shuttle") oder Kanalproteine ( Ionenkanäle erregbarer Membranen) vermittelt. Dabei bindet sich der zu transportierende Stoff auf der einen Seite der Membran an die transportierende Struktur und trennt sich nach der Membranpassage wieder von dieser. Die Substratspezifität solcher Systeme ist nicht so streng. Mit dem gleichen Transportsystem können unterschiedliche Substrate transportiert werden.

 

 

 

1.4.2.2            Aktiver Transport

 

Das Hauptmerkmal des aktiven Transportes ist seine Energieabhängigkeit. Der Aufwand von Energie ist immer dann erforderlich, wenn ein Stoff entgegen seines Konzentrationsgefälles oder elektrischen Gefälles (Potential) "bergauf" transportiert werden muß. In Abhängigkeit davon, ob die aufgewendete Energie direkt für den Transportprozeß (ATPasen) oder erst über einen Umweg in Form eines Konzentrationsgefälles für einen anderen Stoff bereitgestellt wird, unterscheidet man primär- und sekundär-aktiven Transport. Wenn die in ein Konzentrationsgefälle transformierte Energie für den Transport in die gleiche Richtung gebraucht wird, spricht man von einem Symport, beim Transport in die Gegenrichtung des Transportgefälles von einem Antiport oder Counterport.

Solche aktiven Transportmechanismen sind u.a. dadurch charakterisiert, daß sie sättigbar (eingeschränkte Transportkapazität), spezifisch (kompetetive Hemmung) und von der Energiebereitstellung der Zellen abhängig sind.

 

Die Transportrate (v) eines solchen sättigbaren Transportes errechnet sich meist nach der Michaelis-Menten-Kinetik:

 

v = Vmax*[S] / (Km+[S]) [mol*m-2*s-1],

 

wobei [S] die aktuelle Konzentration der zu transportierenden Substanz, Vmaxdie maximale Transportrate der Substanz und Km deren Konzentration bei Halbsättigung (1/2 Vmax) bedeutet. Demnach ergibt sich bei Darstellung der Konzentration gegen die Transportrate ein logarithmischer Kurvenverlauf mit asymptotischer Annäherung an Vmax.

 

Eine besondere Form des aktiven Transportes ist die Endozytose. Sie beinhaltet die Bildung von membranumschlossenen Vesikeln , die 50-400 nm Durchmesser haben und sich unter ATP-Verbrauch von der Plasmamembran abschnüren. Bei der Endozytose werden zwei Formen unterschieden, die Pinozytose und die rezeptorvermittelte Endozytose.

Bei der Pinozytose findet eine kontinuierliche Aufnahme von Extrazellulärflüssigkeit über relativ kleine Vesikel statt. Dieser Aufnahmeprozeß ist unspezifisch und hat eine relativ geringe Kapazität. Mit dem umgebenden Medium werden die darin enthaltenen Stoffe mit aufgenommen.

Die rezeptorvermittelte Endozytose (adsorbtive Endozytose) ist eine sehr spezifische Form der Stoffaufnahme. Nach Bindung der Substratmoleküle an ihren Rezeptoren (diese sind oft in großen Gruppen auf der Membran zusammengezogen und innen mit speziellen Proteinen bedeckt) wird die Plasmamembran eingestülpt, die Substrat-Rezeptorkomplexe mit der Plasmamembran umhüllt und der gesamte Vesikel internalisiert ("coated Vesikel"). Meist erfolgt eine Fusion der endozytotischen Vesikel mit primären Lysosomen zu sekundären Lysosomen. Dabei kann der Substrat-Rezeptorkomplex abgebaut werden oder aber der Rezeptor ohne sein Substrat  wieder in die Zellmembran eingebaut werden.

 

 

 

1.4.3   Aufnahme natürlicher Eisenverbindungen

 

Als natürliche Eisenverbindungen werden hier die Verbindungen bezeichnet, die unter physiologischen oder pathologischen Umständen im Körper selbst entstehen. Diese Verbindungen werden in mehreren Gruppen zusammengefaßt. Es wird zwischen Transferrin-gebundenem Eisen, spezifischem nicht-Transferrin-gebundenem Eisen (Ferritin, Hämoglobin-Haptoglobin, Häm-Hämopexin, Häm-Albumin, Laktoferrin) und unspezifischem nicht-Transferrin-gebundenem Eisen (Fe-Citrat, Fe-Ascorbat, u.a. Eisenkomplexe = NTB-Eisen) unterschieden. Einen Überblick über die Aufnahme der verschiedenen Eisenverbindungen gibt Abb. 3.

 

 

Transferrin-gebundenes-Eisen

Der größte Anteil des Transferrins wird durch rezeptorvermittelte Endozytose aufgenommen. Dies konnte an Retikulozyten, an Hepatozyten und anderen Zellen nachgewiesen werden (Morgan und Appleton 1969; Hannover und Dickson 1985). Dabei stellt die Endozytose des Transferrin-Rezeptor-Komplexes einen essentiellen Bestandteil der Eisenaufnahme dar (Morgan und Baker 1988). Nach Freisetzung und transmembranärem Transport des Eisens wird der Transferrin-Rezeptor-Komplex nicht abgebaut, sondern durch Einbau in die Plasmamembran wiederverwertet.

Als weiterer Aufnahmeweg für transferringebundenes Eisen in die Zellen, insbesondere für Hepatozyten, wird ein reduktionsabhängiger Prozeß an der Plasmamembran angesehen, der sich in enger Nachbarschaft zum Transferrinrezeptor befindet oder

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abbildung 3:           Aufnahmemechanismen der natürlichen Eisenverbindungen

 

 

sogar mit diesem assoziiert sein muß (Thorstensen und Romslo 1988; Scheiber und Goldenberg 1996). Die Reduktion des Eisens wird dabei durch eine zellmembranassozierte NADH-Ferricyanid-Oxidoreduktase vermittelt, die in Hepatozyten eine viel höhere Konzentration aufweist als in Retikulozyten (Thorstensen 1988). Es konnte gezeigt werden, daß dieser transmembranäre Prozeß sowohl an der äußeren Plasmamembran als auch nach Endozytose in Endosomen stattfindet (Goldenberg et al. 1988; 1991). Da ein großer Teil der Endosomenmembran aus der Plasmamembran besteht, läßt sich vermuten, daß dasselbe Enzym bei der rezeptorvermittelten endozytotischen Transferrin-Eisenaufnahme an der Freisetzung des Eisens beteiligt sein könnte.

 

Spezifisches nicht-Transferrin-gebundenes Eisen

Außer Transferrin gibt es eine Reihe weiterer Proteine, die Transportproteine für Eisen darstellen. Unter physiologischen Umständen ist ihr Anteil am Eisenstoffwechsel relativ gering. Erst unter pathologischen Umständen (Hämochromatose, hämolytische Anämie) oder besonderen physiologischen  Umständen (Schwangerschaft) gewinnen sie an Bedeutung.

 

Ferritin im Serum ist bei der Hämochromatose und durch den Untergang von Leberzellen bei anderen Leberkrankheiten erhöht. Seine Aufnahme in die Hepatozyten wird über zwei Wege, eine rezeptorvermittelte und eine unspezifische Endozytose, vermittelt (Osterloh und Aisen 1989). Nach der Aufnahme wird das Ferritin in Lysosomen abgebaut und das Eisen dem intrazellulären Eisenpool zugeführt.

 

Haptoglobin bindet freies Hämoglobin und transportiert dieses zur Leber. Dort wird dieser Komplex durch rezeptorvermittelte Endozytose in die Hepatozyten aufgenommen (Kino et al. 1980). Nach der Aufnahme wird das Haptoglobin in den Lysosomen abgebaut (Higa et al. 1981).

 

Sowohl Hämopexin als auch Albumin sind in der Lage, freies Häm im Serum zu binden und den Hepatozyten zur Aufnahme zuzuführen. Der Häm-Hämopexin Komplex wird durch rezeptorvermittelte Endozytose in die Hepatozyten aufgenommen, wobei das rezeptorgebundene Hämopexin nicht abgebaut, sondern nach der Freisetzung des Häms in den Lysosomen wieder in die Zellmembran eingebaut wird (Smith und Morgan 1978; 1979). Das an Albumin gebundene Häm dissoziiert wahrscheinlich vor der Aufnahme und gelangt durch Diffusion in Hepatozyten und andere Zellen.

 

Im menschlichen Organismus ist Laktoferrin unter physiologischen Umständen in relativ geringen Konzentrationen vorhanden. Besondere Bedeutung kommt ihm bei Schwangeren und Patienten mit myeloischer Leukämie zu, was sich in erhöhten Plasmawerten widerspiegelt. Aufgenommen wird das Laktoferrin von den Zellen der Leber (Hepatozyten, Kupfer`sche Zellen u.a.) durch rezeptorvermittelte Endozytose (Mc Abee und Esbensesen 1991).

 

 

Unspezifisches nicht-Transferrin-gebundenes Eisen

Bei Patienten mit hereditärer Hämochromatose sind die niedermolekularen Eisenverbindungen im Plasma im Vergleich zu Gesunden signifikant erhöht (Batey et al. 1978). Der Hauptteil dieses Eisens wurde als Fe-Citrat identifiziert (Grootveld et al. 1989). Es konnte gezeigt werden, daß die Leberzellen unabhängig von ihrem Eisengehalt diese Form des Eisens sehr effizient aus dem Plasma entfernen können (Wright et al. 1986). Untersuchungen zum Aufnahmemechanismus ergaben, daß niedermolekulare Eisenverbindungen spezifisch und carrier-vermittelt aufgenommen werden (Wright et al. 1986) Dabei wird die Triebkraft dieser elektrogenen Eisenaufnahme anscheinend durch die transmembranäre Potentialdifferenz geliefert (Wright et al. 1987). Für diese Form der Eisenaufnahme scheint  an verschiedenen Zellen die Reduktion von Fe3+ zu Fe2+ durch eine an das Transportprotein eng gekoppelte Ferrireduktase eine wichtige Rolle darzustellen (Inman et al. 1993; 1994; Jordan und Kaplan 1994; Randell et al. 1994).

 

 

 

1.5      Ziel der vorliegenden Arbeit

 

Ferrozene als eisenhaltige organische Substanzen zur Erzeugung von schweren Hämosiderosen für experimentelle Zwecke sind schon länger bekannt. Ihre große hämosiderotische Potenz wird auf Ihren lipohilen Charakter zurückgeführt. Eine genaue Untersuchung der Aufnahme der Ferrozene auf zellulärer Ebene ist bislang nicht erfolgt.

 

Im Rahmen dieser Arbeit soll die Aufnahmekinetik und der Aufnahmemechanismus von Ferrozen und TMH-Ferrozen im Vergleich zur Aufnahme von komplexiertem Eisen in Form von Fe-Askorbat, Fe-DTPA und Fe-Citrat experimentell näher charakterisiert werden.

 

Voraussetzung hierfür ist die Überprüfung der Anwendbarkeit einer bereits bekannten Methode von Scheiber und Goldenberg (1996) auf die lipophilen Ferrozene. Im Zusammenhang damit gilt es, einen geeigneten Lösungsvermittler für die lipophilen Ferrozene im wäßrigen Inkubationsmedium zu finden.

 

Vorstellbar erscheint hier, das Ferrozene eine neue Möglichkeit bieten, Eisen auf nicht-pysiologischem Wege effektiv in die Zelle einzubringen. Dadurch wäre die Untersuchung von physiologischen Transportwegen des Eisens z.B. aus der Zelle heraus ohne störende Interferenzen mit anderen Transportmechanismen möglich.