Die Expression respiratorischer Proteine ausgewählter Arthropodenspezies

Abstract

Hämoglobine und Hämocyanine erfüllen in vielen Arthropoden eine Funktion im Transport und in der Speicherung von Sauerstoff. Hämoglobine gehören zu der Klasse der Häm-Proteine, die sich alle durch den Besitz eines metallhaltigen Porphyrinkomplexes auszeichnen. Die reversible Bindung von Sauerstoff wird durch das zentral im Häm vorliegende, zweiwertige Eisenion ermöglicht. Im Gegensatz dazu binden Arthropoden-Hämocyanine mit Hilfe zweier Kupferionen Sauerstoff. Sie bilden stets Hexamere bzw. Multihexamere aus sechs ähnlichen oder identischen Untereinheiten, wobei jede dieser ca. 75 kDa Untereinheiten ein Kupferzentrum besitzt. Die Hämocyanine der Arthropoden werden mit vier hämocyanin-ähnlichen Proteinklassen bestehend aus Enzymen (Phenoloxidasen), Speicherproteinen (Pseudohämocyanine und Hexamerine) sowie bestimmten Rezeptoren (Hexamerinrezeptoren) zu der Hämocyanin-Superfamilie der Arthropoden zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Identifizierung und Charakterisierung dieser zwei respiratorischen Proteine in ausgewählten Krebstieren. Mit dem kiemenspezifischen Hämoglobin (CmaHb) der Strandkrabbe Carcinus maenas (Decapoda, Malacostraca) wurde erstmals ein intrazelluläres Globin in den Crustacea nachgewiesen. CmaHb weist eine Membranlokalisation auf, die bislang nur im Falle einiger bakterieller Globine beschrieben wurde. CmaHb ist dabei das erste bekannte Globin, bei dem die Interaktion mit der Membran über eine N-Myristoylierung vermittelt wird. Sequenzanalysen wiesen darauf hin, dass neben CmaHb auch Globinsequenzen der Chelicerata sowie zumindest zwei Globine der Insecta ein N-terminales Motiv für eine N-Myristoylierung besitzen. Phylogenetische Analysen lassen vermuten, dass eine intrazelluläre, membrangebundene Lokalisation die ursprüngliche Form der Arthropoden-Globine darstellt. Aus diesen sind offensichtlich die intrazellulären, frei im Cytoplasma vorliegenden Globine der Insecta sowie die extrazellulären Globine der Insecta und Branchiopoda (Crustacea) hervorgegangen. Hypothesen zur Funktion des CmaHb umfassen den Schutz der Kiemenmembran vor ROS oder eine Rolle in einem noch unbekannten Signaltransduktionsprozess. Eine respiratorische Funktion ist dagegen aufgrund einer hohen Autoxidationsrate des CmaHb unwahrscheinlich. Ferner wurde am Versuchstier Speleonectes tulumensis (Remipedia) zum ersten Mal eindeutig die Expression eines respiratorischen, extrazellulären Hämocyanins außerhalb der Malacostraca belegt. Die drei Hämocyaninuntereinheiten gruppieren in allen phylogenetischen Analysen mit den Hämocyaninen der Insekten. Auffällig ist dabei, dass dieser Krebs beide Untereinheitstypen besitzt, die in Insekten vorkommen. Die erhaltenen Resultate weisen somit auf ein mögliches Schwestergruppenverhältnis der Remipedia und Insecta sowie folglich auf eine Paraphylie der Crustacea hin. Jedoch sind weitere Analysen notwendig, um die Stellung der Remipedia sowie ihre Verwandtschaft zu den Hexapoda zu untersuchen. Im Rahmen eines dritten Projektes wurden erstmalig rekombinante Expressionssysteme für ausgewählte Mitglieder der Hämocyanin-Superfamilie der Arthropoden etabliert. Am Beispiel der Prophenoloxidase 3 (PPO3) aus D. melanogaster gelang es, einen kupferhaltigen Vertreter in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Parallel durchgeführte Arbeiten mit heterologen, bakteriellen Expressionsystemen zeigten, dass sich auch diese prinzipiell für die rekombinante Expression der Proteine dieser Superfamilie eignen. So gelang am Beispiel des Hexamerins LSP2 von D. melanogaster die Expression eines löslichen, kupferlosen Vertreters in E. coli. Nach Aufreinigung der rekombinanten LSP2-Untereinheiten konnte die Quartärstruktur des Proteins erfolgreich rekonstituiert werden. Bei der rekombinanten Expression der Kupferproteine in E. coli wurden ebenfalls gravierende Fortschritte erzielt, da erstmals die rekombinante Herstellung einer Phenoloxidase und eines Hämocyanins als lösliches Apoprotein in Bakterien gelang. Mit der in dieser Arbeit erreichten rekombinanten Expression einer funktionellen Phenoloxidase und eines Hexamerins stehen somit bereits zwei Vertreter der Arthropoden-Hämocyanin-Superfamilie in ausreichender Menge zur Verfügung, die für bioanalytische Studien eingesetzt werden können.