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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-100619
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/10061/


Structural and biochemical analysis of selected nucleic acid-protein complexes

Strukturelle und biochemische Untersuchungen von ausgewählten Nukleinsäure-Protein-Komplexen

Schmidt, Christina

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Biochemie , Strukturbiologie , Molekularbiologie , Röntgenstrukturanalyse , Strukturaufklärung
Freie Schlagwörter (Englisch): Biochemistry , Structural Biology , Molecular Biology , X-ray diffraction
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.09.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 24.10.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle und biochemische Informationen über einen Transkriptionsfaktor aus dem pathogenen Bakterium Mycobacterium avium ssp. paratubeculosis (MAP) und einem L-RNA-Aptamer, in Komplex mit dem wichtigen Appetit anregenden Peptid Ghrelin, gewonnen. Der erste Teil dieser Arbeit umfasst die Untersuchung des Peroxids empfindlichen Transkriptionsfaktors (MAP Ferric Uptake Regulator, FurA) MAP, der Erreger der Paratuberkulose bei Wiederkäuern. Diese Krankheit ist oft tödlich und verursacht enorme wirtschaftliche Verluste. In dieser Arbeit werden erste strukturelle Informationen zu MAP FurA vorgestellt. Zum ersten Mal wurde die offene und die geschlossene Konformation von MAP FurA beobachtet, während die offene Form vermutlich DNA binden kann, um die Genexpression zu regulieren. Es konnte gezeigt werden, dass MAP FurA neben Zink auch Mangan und Eisen binden kann. Dies könnte darauf hindeuten, dass bei der Bindung verschiedener Metallionen ein Feinabstimmungsmechanismus der Regulation in Abhängigkeit von der aktuellen cytosolischen Zusammensetzung möglich ist. Das Apo Protein und die oxidierte Form liegen in geschlossener Form vor, was in einem Verlust der DNA-Bindung resultieren könnte. Wenn oxidativer Stress auftritt, wird Eisen oxidiert und vom Protein dissoziiert, woraufhin eine Konformationsänderung stattfindet.
Der zweite Teil der Arbeit umfasst strukturelle Analysen des Ghrelin•NOX-B11-Komplexes und stellt verschiedene Methoden für die experimentelle Bestimmung der Phaseninformation von Nukleinsäure-haltigen Kristallen vor. Die Entwicklung von SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment; dt: systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) führte zur Entwicklung von RNA-/DNA-Aptameren, die über ihre 3D-Struktur mit hoher Affinität an ihre Zielmoleküle binden. Spiegelmere wurden von der NOXXON Pharma AG entwickelt und sind Aptamere, die aus den stereochemischen Spiegelbildern der natürlich vorkommenden Nukleotide (L-Nukleotide) bestehen, und daher gegenüber Nukleasen nicht anfällig sind. NOX-B11 ist ein Spiegelmer, der das aktive Octanoyl-Ghrelin mit hoher Affinität bindet und dessen Wirksamkeit nachgewiesen wurde. Ghrelin ist ein Appetit anregendes Peptid, das mit verschiedenen physiologischen Prozessen in Verbindung gebracht wird, hauptsächlich bei der Regulation des Lebensmittelstoffwechsels und des Hungers. Die aktive Form von Ghrelin, das seinen Rezeptor (growth hormone secretagogue receptor (GHSR) 1a) bindet, hat eine posttranslationale und für Säugetiere einzigartige Modifizierung, eine am Ser3 gebundene Fettsäuren-Seitenkette. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erste Strukturinformationen über die Komplexbildung gewonnen. Es wurde gezeigt, dass die L RNA und der Komplex hochstabil sind. In-situ-DLS-Studien zeigten eine Konformationsänderung des Spiegelmers nach Ghrelin-Zugabe. Die Stabilität der L-RNA und des Komplexes wurde über einen Zeitraum von 40 Tagen überwacht. Weiterhin konnten SAXS Messungen die Konformationsänderung bestätigen. Kristallisationsversuche wurden durchgeführt und es war möglich, für Röntgenbeugungsexperimente geeignete Kristalle zu erhalten. Röntgenbeugungsdaten wurden von einem Einkristall mit einer Auflösung von 2.65 Å gesammelt, in der Raumgruppe C2. Da weder strukturelle Informationen über das Spiegelmer noch über Ghrelin bekannt waren, wurden verschiedene Methoden zur Phasenbestimmung angewendet. Das Phasenproblem der Kristallographie ist nach wie vor der größte limitierende Faktor bei der Strukturbestimmung, da nur die Amplituden einer Reflexion, und nicht die Phasen, gemessen werden können. Natives SAD ist ein vergleichsweiser neuer Ansatz zur Phasenrückgewinnung, bei dem die intrinsischen Atome (z.B. Phosphor für Nukleinsäuren) als anomale Streuer verwendet werden. Die Daten müssen hochredundant sein und ein möglichst geringes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen. Um die relativ schwachen anomalen Signale zu verstärken, wurden Diffraktionsdaten bei langen Wellenlängen an speziell dafür konzipierten Beamlines gemessen (EMBL Beamline P13 und I23 an der Diamond Light Source). Es wurden mehrere Datensätze gesammelt und statistisch ähnliche Kristalle kombiniert, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis, sowie das anomale Signal erhöht werden konnten. Da die Substrukturlösung nicht erfolgreich war, wurden Schweratomderivate erzeugt. Kobalt-Derivatdaten wurden gesammelt mit einer Auflösung von bis zu 2.3 Å. Da die Phasenwiederherstellung fehlschlug, wurde mehrere helikale Fragmente als Suchmodelle für molekularen Ersatz verwendet, was jedoch ebenfalls erfolglos blieb. 3D-RNA-Modelle wurden unter Einbeziehung der durch SAXS-gewonnenen experimentellen Daten generiert. Das Modell, das am besten zu den experimentellen SAXS-Daten passte, wurde als Suchmodell für den molekularen Ersatz verwendet, aber auch eine Strukturlösung war nicht möglich.
Kurzfassung auf Englisch: In the course of this work, structural and biochemical information about a transcription factor from the pathogenic Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis and of an L-RNA aptamer, in complex with the orexigenic Peptide ghrelin, was obtained. In the first part of the thesis the peroxide sensitive, transcription factor Ferric Uptake Regulator (FurA) from Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), the causative agent for paratuberculosis in ruminants and especially in livestock, was studied. This disease is often fatal and responsible for huge economic losses for the livestock industry worldwide. Here, first structural information about MAP FurA is presented. For the first time, the open and the closed confirmation of MAP FurA were observed, where the open form is putatively able to bind DNA to regulate gene expression. The open form is the metalized, unoxidized MAP FurA. It was shown, that MAP FurA is able to bind manganese and iron, as well as zinc. This might indicate, that upon binding of different metal ions, a fine-tuning mechanism of regulation is possible, depending on the current cytosolic composition. The apo-protein and the oxidized form are in the closed form, indicating that these forms are not able to bind DNA. When peroxide stress is occurring, the iron gets oxidized and dissociated from the protein resulting in a conformational change. Crystallization trials were performed and first initial microcrystals were obtained. Further optimization is needed to obtain structural information about the metal binding and DNA interaction.
The second part of this thesis provides structural insights into the Ghrelin•NOX-B11 complex and presents several methods that can be used for phase retrieval for nucleic Acid containing crystals. In the 1990s the development of SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) led to the development of aptamers, a novel group of DNA or RNA molecules that bind to their cognate targets with high affinity via their 3D structure. Spiegelmers were developed by the NOXXON Pharma AG and are a Special class of aptamers that consist of unnatural L-nucleotides and are hence not susceptible to endo- and exo-nucleases. NOX-B11 is a Spiegelmer that binds the active octanoyl-ghrelin with high affinity and effectiveness has been demonstrated in vitro and in vivo. Ghrelin is an orexigenic peptide that is associated with various physiological processes, mostly in the regulation of food metabolism and hunger. It is therefore an important drug target. The active form of ghrelin, which binds its receptor (growth hormone secretagogue receptor (GHSR)1a), has a posttranslational, and for mammals unique, modification, namely a fatty acid side chain bound at Ser3. Here, first structural information About complex formation was obtained. It was shown, that the L-RNA and the complex are highly stable. In situ DLS studies revealed a conformational change of the Spiegelmer upon ghrelin addition and stability of the L-RNA and the complex was monitored over 40 days. Furthermore, SAXS measurements demonstrated the conformational change as well, as the L-RNA transitions from an elongated molecule to a more compact complex with ghrelin. Extensive crystallization trials were performed and it was possible to obtain X-ray diffraction suitable crystals. X-ray diffraction data were collected from a single crystal to a resolution of 2.65 Å and the space group was determined to be C2. Since no structural information about the Spiegelmer, nor ghrelin, was known, several Phase retrieval methods were applied. The phase problem of crystallography is still the main bottleneck of structure determination, as only the amplitudes of a reflection can be measured and the phases are not observed. Native SAD is a comparatively new Approach for phase retrieval, using the intrinsic atoms (sulfur for proteins, phosphorous for nucleic acids) as anomalous scattering atoms. Data needs to be highly redundant and with as low signal/noise ratios as possible. To enhance the small anomalous signals data were measured at long wavelengths at designated beamlines at EMBL Beamline P13 and I23 at the Diamond Light source. Multiple datasets were collected and multi crystal analysis was performed. After cluster analysis, the I/σ and ΔF/σ(ΔF) was enhanced and data were subjected to substructure solution. As substructure solution was not successful, heavy atom derivatives were generated. Cobalt-derivative data were collected and Crystals diffracted up to 2.3 Å. Since phase retrieval failed, molecular replacement with Fragments was applied, but was also unsuccessful. SAXS data information were used as restraints for 3D RNA modelling. The best model that fit to the SAXS experimental data was used as a search model, but structure solution was again not successful.


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