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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-84524
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/8452/


Hydrogenases from a hydrothermal deep-sea vent metagenome and the development of a novel activity-based screen to identify H2 uptake active enzymes from metagenomic libraries

Hydrogenasen aus einem Metagenom einer hydrothermalen Tiefsee-Quelle und die Entwicklung einer neuartigen aktivitätsbasierten Screening-Methode zur Identifizierung von H2 uptake aktiven Enzymen aus Metagenombanken

Rychlik, Nicolas

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Metagenomik , Hydrogenase , Shewanella oneidensis , hydrothermale Tiefseequellen , aktivitätbasierte Screening-Methode
Freie Schlagwörter (Englisch): metagenomic , hydrogenase , Shewanella oneidensis , hydrothermal deep-sea vents , activity-based screen
Basisklassifikation: 42.30
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Perner, Mirjam (Jun.-Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.06.2016
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 11.07.2019
Kurzfassung auf Englisch: The ability to use H2 as an energy source is widely distributed among chemolithotrophic organisms. The interconversion between molecular H2 and protons and electrons is catalyzed by enzymes called hydrogenases. The aim of this study was the identification and investigation of novel, preferably oxygen tolerant hydrogenase enzymes. The sought hydrogenases were searched in metagenomic material originated from hydrothermal deep-sea vent habitats, because hydrothermal deep-sea vents are described as habitats with a high physiologic and taxonomic richness including a large number of diverse H2-oxidizing microorganisms. Consequently, these habitats have a great potential for a successful searching for novel hydrogenases. Therefore, a novel function-based screening approach for environmental metagenomic libraries was developed to investigate metagenomic material conserved in broad host range fosmid libraries to identify the searched hydrogen uptake active enzymes. For the realization of the developed function-based screen, an alternative host was chosen to optimize the capability of maturation and assembly of heterologous hydrogenases and to circumvent the tap of the tremendous resources of uncultivated hydrogen oxidizing microbes in hydrothermal deep-sea vent habitats. Hereby a constructed ΔhyaB deletion mutant of Shewanella oneidensis MR-1 (H2 uptake ability is lost) is used as alternative heterologous host and is complemented with fosmids from a hydrothermal deep-sea vent metagenomic library. Within die developed function-based screen the S. oneidensis wild type phenotype is restored and H2 is consumed again if a fosmid exhibits H2 uptake activity and can complement the S. oneidensis ΔhyaB deletion mutant. This is detectable in the function based screen by a color change in the medium. This is the first described function-based screen for seeking H2 uptake active hydrogenases from metagenomic fosmid libraries.
In this study 7.776 fosmids of a metagenomic library constructed from a deep-sea hydrothermal venting chimney sample (Sisters Peak) were function-based screened for H2 uptake activity and 14 fosmids with putative H2 uptake activity were recovered. From these 14 fosmids two identified fosmids, namely pRS44::SP-P05F01 (P05F01) and pRS44::SP-P18F11 (P18F11), were investigated on the hydrogenase activity level in detail and were completely sequenced. The fosmid P05F01 exhibited high similarities to genes encoded on the hydrogenase operon of the Epsilonproteobacteria Nitratifractor salsuginis. In S. oneidensis ΔhyaB the recombinant hydrogenase from the P05F01 fosmid enabled the consumption of H2, exhibited an in vitro H2 uptake activity at 25 °C, 55 °C and 70 °C (25 °C: 219.5 ± 54.4 nmol * min-1 * mg-1 total protein, 55 °C: 2677.0 ± 941.4 nmol * min-1 * mg-1 total protein, 70 °C: 12001.5 ± 1035.1 nmol * min-1 * mg-1 total protein) and showed a H2 evolution rate of 1.15 ± 0.20 µmol H2 * min-1 * mg-1 total protein at 28 °C. The second fosmid with H2 uptake activity was fosmid P18F11, which showed similarity to six genes of the Euryarchaeota Aciduliprofundum sp. MAR08-339, not known to consume H2. Although the fosmid P18F11 enabled the consumption of H2, an in vitro H2 uptake activity could be measured at 25 °C, 55 °C and 70 °C (25 °C: 45.8 ± 9.1 nmol * min-1 * mg-1 total protein, 55 °C: 292.6 ± 96.7 nmol * min-1 * mg-1 total protein, 70 °C: 1331.5 ± 223.5 nmol * min-1 * mg-1 total protein) and this strain showed a H2 evolution rate of 0.29 ± 0.02 µmol H2 * min-1 * mg-1 total protein at 28 °C, no classical hydrogenase gene was identified on the fosmid or on the homologous region of A. sp. MAR08-339’s genome (based on known sequences) that could be allocated to the H2 uptake function. The 12 further S. oneidensis ΔhyaB fosmid clones with putative H2 uptake activity were also investigated in detail, but an existing H2 uptake hydrogenase activity mediated by encoded genes on the fosmids has not been confirmed by repeating the developed functional screen, by measuring H2 uptake turnover rates and by sequencing the 5’/3’ fosmid ends. For seeking metagenomic hydrogenases by the developed functional screen in the future, the repeatability of positive screening results must be improved to gain reliable results therewith false positive hits are excluded and don’t occur as observed for the 12 S. oneidensis ΔhyaB fosmid clones with putative H2 uptake activity.
Nevertheless, this study illustrates that H2 uptake hydrogenases from an environmental sample can be identified using the developed novel culture-independent screening procedure. It further demonstrates the great potential of recovering genes encoding novel H2 uptake active enzymes previously not associated with this type of activity from environmental samples.
Kurzfassung auf Deutsch: Die Fähigkeit zur Nutzung von H2 als Energiequelle ist weit verbreitet innerhalb chemolithotropher Organismen. Die Spaltung und Produktion von molekularem H2 in / aus Protonen und Elektronen wird hierbei von Enzymen, den Hydrogenasen, katalysiert. Das Ziel dieser Studie war die Detektion und Analyse von neuen, möglichst Sauerstoff-toleranten Hydrogenasen. In dieser Studie wurde eine Metagenombank, generiert aus Material einer hydrothermalen Tiefseequelle, durchmustert, um entsprechende Hydrogenasen zu detektieren. Da hydrothermale Tiefseequellen als Habitate beschrieben werden, an denen eine hohe physiologische und taxonomische Diversität inklusive einer hohen Anzahl an H2-oxidierenden Mikroorganismen vorherrscht, haben diese Habitate ein hohes Potential für eine erfolgreiche Suche nach neuen, nicht beschriebenen Hydrogenasen. Hierfür wurde eine neue funktions-basierte Screening-Methode zur Durchmusterung von Metagenombanken aus Umweltproben entwickelt und anschließend genutzt, um die gesuchten Enzyme mit einer H2-uptake Aktivität innerhalb des metagenomischen Materials einer hydrothermalen Tiefseequelle, konserviert in einer Metagenombank mit einem breiten Wirtsspektrum, zu identifizieren. Zur Realisierung der neuen funktions-basierten Screening-Methode wurde gezielt ein alternativer Wirt gewählt, um eine Optimierung der Fähigkeiten zur Maturierung und Assemblierung von heterolog exprimierten Hydrogenasen innerhalb des Wirtes zu erreichen und um damit die enormen Ressourcen der bisher unkultivierten H2-oxidierenden Mikroorganismen innerhalb einer Probe effizienter zu erfassen und zu untersuchen. Dies wurde erreicht indem eine ΔhyaB Deletionsmutante von S. oneidensis MR-1 erstellt und als heterologer Wirt für die Metagenombank, erstellt aus Material einer hydrothermalen Tiefseequelle, genutzt wurde. Die S. oneidensis ΔhyaB Deletionsmutante ist nicht mehr fähig H2 als Energiequelle zu nutzen. Innerhalb der entwickelten funktions-basierten Screening-Methode wird die Fähigkeit der S. oneidensis ΔhyaB Deletionsmutante zur Konsumierung von H2 wiederhergestellt, sobald auf einem untersuchten Fosmid Gene für Enzyme mit einer H2-uptake Aktivität kodiert und in S. oneidensis ΔhyaB heterolog exprimiert werden. Diese Komplementierung ist mittels der entwickelten funktions-basierten Screening-Methode über ein Farbwechsel innerhalb des Kulturmediums detektierbar. Dies ist die erste beschriebene funktionsbasierte Screening-Methode zur Identifikation von Enzymen mit H2-uptake Aktivität aus metagenomischen Fosmidbanken.
In dieser Studie wurde eine Metagenombank mir 7.776 Fosmiden, konstruiert aus Material eines Schornsteins einer hydrothermalen Tiefseequelle (Sisters Peak), nach Enzymen mit H2-uptake Aktivitäten funktions-basiert durchmustert. Hierbei wurden 14 Fosmide mit mutmaßlicher H2-uptake Aktivität detektiert. Von diesen 14 Fosmiden wurden zwei Fosmide, nämlich pRS44::SP-P05F01 (P05F01) und pRS44::SP-P18F11 (P18F11), genauer im Hinblick auf ihre Hydrogenase-Aktivitäten untersucht und zudem komplett sequenziert. Die ORFs auf Fosmid P05F01 zeigten hohe Ähnlichkeiten zu Genen des Hydrogenase Operon von dem Epsilonproteobakterium Nitratifractor salsuginis. In S. oneidensis ΔhyaB ermöglichte die rekombinante Hydrogenase auf P05F01 eine Wiederherstellung des H2 Konsums, es konnten in vitro H2-uptake Aktivitäten bei 25 °C, 55 °C und 70 °C gemessen werden (25 °C: 219,5 ± 54,4 nmol * min-1 * mg-1 Gesamt-Protein, 55 °C: 2.677,0 ± 941,4 nmol * min-1 * mg-1 Gesamt-Protein, 70 °C: 12.001,5 ± 1035,1 nmol * min-1 * mg-1 Gesamt-Protein) und eine H2 Produktion von 1,15 ± 0,20 µmol H2 * min-1 * mg-1 Gesamt-Protein bei 28°C wurde ermittelt. Das zweite Fosmid mit H2-uptake Aktivität war das Fosmid P18F11, welches auf Sequenzebene Ähnlichkeiten zu sechs Genen des Euryarchaeota Aciduliprofundum sp. MAR08-339 zeigte, wobei für diese Spezies die Fähigkeit H2 als Energiequelle zu nutzen nicht bekannt ist. Das Fosmid P18F11 ermöglichte dem heterologen Wirt S. oneidensis ΔhyaB die Konsumierung von H2, zudem konnte eine in vitro H2-uptake Aktivität bei 25 °C, 55 °C und 70 °C gemessen werden (25 °C: 45,8 ± 9,1 nmol * min-1 * mg-1 Gesamt-Protein, 55 °C: 292,6 ± 96,7 nmol * min-1 * mg-1 Gesamt-Protein, 70 °C: 1331,5 ± 223,5 nmol * min-1 * mg-1 Gesamt-Protein) und es konnte für die komplementierte Deletionsmutante eine H2 Produktion in Höhe von 0,29 ± 0,02 µmol H2 * min-1 * mg-1 Gesamt-Protein bei 28 °C ermittelt werden. Allerdings konnte weder auf dem sequenzierten Fosmid, noch auf dem Genoms von A. sp. MAR08-339 ein Gen für eine klassische Hydrogenase gefunden werden, dass für die beobachtete Hydrogenase Aktivität verantwortlich sein könnte. Die 12 weiteren S. oneidensis ΔhyaB Fosmid Klone mit putativen H2-uptake Aktivitäten wurden auch genauer untersucht. Allerdings konnte eine existierende H2-uptake Aktivität, vermittelt durch die Gene enkodiert auf die entsprechenden Fosmiden, weder durch das mehrfache Wiederholen der entwickelten Screening-Methode bestätigt werden, noch durch Messung von in vitro H2-uptake Aktivität, und auch nicht durch Sequenzierung der Fosmid 5‘ / 3‘ Enden. Diese Ergebnisse zeigten, dass zur zukünftigen Detektion metagenomischer Hydrogenasen die entwickelte funktionelle Screening-Methode weiter verbessert werden sollte, um zuverlässigere und wiederholbare positive Ergebnisse zu erhalten und zukünftig falsch positive Ergebnisse, wie sie für die 12 putativ positiven Klone beobachtet wurden, möglichst komplett auszuschließen.
Nichtsdestotrotz zeigt diese Studie, dass H2-uptake Hydrogenasen aus Umweltproben über die neu entwickelte Kultur-unabhängige Screening-Methode identifiziert werden können. Des Weiteren demonstriert die Studie das große Potential zur Entdeckung von Genen aus Umweltproben, die für neuartige Enzyme mit H2-uptake Aktivitäten kodieren, welche vorher nicht mit diesem Typ von Aktivität assoziiert wurden.

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