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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-96062
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9606/


Measuring glutamate transients at Schaffer collateral synapses

Messung von Glutamat-Transienten an Schaffer-Kollateral-Synapsen

Dürst, Céline

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Optogenetik , Glutamate , Synapse
Freie Schlagwörter (Deutsch): genetisch kodierter Glutamatsensor , Zwei-Photonen Microscop , Quantalanalyse
Freie Schlagwörter (Englisch): genetically encoded glutamate sensor , two-photon microscope , quantal analysis
Basisklassifikation: 42.99
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Oertner, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.12.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 29.04.2019
Kurzfassung auf Englisch: In the mammalian cortex, glutamatergic excitatory synapses convert presynaptic action potentials into chemical signals that are sensed by postsynaptic glutamate receptors. The smallest unit or ‘quantum’ of information transmission at chemical synapses is the release of a single transmitter-filled vesicle. Typical presynaptic terminals contain only a small number of docked vesicles. It is therefore difficult to determine how many vesicles are released in response to a single action potential and whether they all contain the same amount of glutamate. Here, I introduce a new strategy to investigate presynaptic release, using the genetically encoded glutamate sensor iGluSnFR to measure glutamate release in the synaptic cleft directly and independently of postsynaptic receptors. I expressed the genetically encoded glutamate sensor iGluSnFR in CA3 pyramidal cells and performed two-photon glutamate imaging on individual Schaffer collateral boutons in CA1. I showed that this probe is sufficiently sensitive to detect fusion of single vesicles at Schaffer collateral boutons in organotypic hippocampal cultures and that I can localize the fusion site on the bouton with high precision. Statistical analysis of response amplitude distributions allowed me to extract the synaptic parameters n, pves, and q. At some boutons, the amplitude distribution of glutamate transients showed distinct quantal peaks, suggesting a very constant number of glutamate molecules per vesicle. During multivesicular release, glutamate concentrations in the synaptic cleft reached very high values, leading to partial saturation of iGluSnFR responses. I showed that the saturation curves of iGluSnFR and endogenous AMPA receptors are very similar, making iGluSnFR an excellent tool to study the release machinery at individual synapses in intact tissue. Under near physiological conditions, Schaffer collateral synapses typically released only a single vesicle (univesicular events). However, almost all synapses increased their release probability and shifted to multivesicular release in high extracellular Ca2+ concentrations. Using dual patch-clamp recordings and Monte Carlo simulations of glutamate diffusion, I showed that the dynamic range of iGluSnFR responses is similar to postsynaptic AMPA receptor currents while the kinetics of the underlying glutamate transients is an order of magnitude faster.
The genetically encoded glutamate sensor iGluSnFR enables visualization of glutamate release from presynaptic terminals at frequencies up to ~10 Hz. However, to resolve glutamate dynamics during high-frequency bursts, faster indicators are required. Here I report the development of fast (iGluf) and ultrafast (iGluu) variants with comparable brightness, but lower affinities for glutamate. Compared to iGluSnFR, iGluu has 5-fold faster kinetics in synapses. I found that iGluu is sufficiently fast to resolve individual glutamate release events, revealing that glutamate is rapidly cleared from the synaptic cleft. Depression of iGluu responses during 100 Hz trains correlates with depression of postsynaptic EPSPs, indicating that depression during high-frequency stimulation is purely presynaptic in origin. Furthermore, I found that at individual boutons, the recovery from depression could be predicted from the amount of glutamate released on the second pulse (paired-pulse facilitation/depression), demonstrating differential frequency-dependent filtering of spike trains at Schaffer collateral boutons.
Kurzfassung auf Deutsch: Exzitatorische Synapsen wandeln präsynaptische Aktionspotentiale in chemische Signale um, die von postsynaptischen Glutamat-Rezeptoren wahrgenommen werden. Die kleinste Einheit oder "Quantum" der Informationsübertragung an chemischen Synapsen ist die Freisetzung eines einzelnen Transmitter-gefüllten Vesikels. Im Kortex der Säugetiere enthalten typische präsynaptische Boutons nur eine kleine Anzahl angedockter Vesikel. Es ist schwierig zu bestimmen, wie viele Vesikel als Reaktion auf ein einzelnes Aktionspotential freigesetzt werden und ob sie alle die gleiche Menge an Glutamat enthalten. In dieser Arbeit stelle ich eine neue Methode zur Untersuchung der präsynaptischen Funktion vor, die den genetisch kodierten Glutamat-Sensor iGluSnFR verwendet, um Glutamat im synaptischen Spalt unabhängig von postsynaptischen Rezeptoren zu messen. Der genetisch kodierte Glutamat-Sensor iGluSnFR wird in CA3 Pyramidalzellen exprimiert und Zwei-Photonen-Glutamat-Bildgebung an einzelnen Schaffer-Kollateral-Boutons in CA1 durchgeführt. Ich zeige, dass der Sensor empfindlich genug ist, um die Fusion einzelner Vesikel an Schaffer-Kollateral-Boutons in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen zu detektieren und dass ich die Fusionsstelle auf dem Bouton mit hoher Präzision lokalisieren kann. Die statistische Analyse der Antwortamplitudenverteilungen erlaubte mich, die synaptischen Parameter n, p und q zu extrahieren. Bei einigen Boutons zeigte die Amplitudenverteilung von Glutamat-Transienten quantale Peaks, was auf eine sehr gleichmäßige Anzahl von Glutamat-Molekülen pro Vesikel schließen lässt. Während der multivesikulären Freisetzung erreichten die Glutamatkonzentrationen im synaptischen Spalt sehr hohe Werte, was zu einer teilweisen Sättigung der iGluSnFR-Antworten führte. Ich zeige, dass die Sättigungskurven von iGluSnFR und endogenen AMPA-Rezeptoren sehr ähnlich sind, was iGluSnFR zu einem exzellenten Werkzeug macht, um die Freisetzungsmaschinerie an einzelnen Synapsen in intaktem Gewebe zu untersuchen. Unter nahezu physiologischen Bedingungen haben Schaffer Kollateral Synapsen in der Regel nur einen einzigen Vesikel (univesikuläre Ereignisse) freigesetzt. Jedoch erhöhten fast alle Synapsen ihre Freisetzungswahrscheinlichkeit und verlagerten sich auf eine multivesikuläre Freisetzung bei hohen extrazellulären Ca2+ Konzentrationen. Anhand von dualen Patch-Clamp-Aufnahmen und Monte-Carlo-Simulationen der Glutamat Diffusion zeige ich, dass der dynamische Bereich der iGluSnFR-Reaktionen den postsynaptischen AMPA-Rezeptor-Strömen ähnelt, während die Kinetik der zugrunde liegenden Glutamat-Transienten um eine Größenordnung schneller ist. Der genetisch kodierte Glutamat-Sensor iGluSnFR ermöglicht die Visualisierung der Glutamatfreisetzung aus präsynaptischen Terminals bei Frequenzen bis zu ~ 10 Hz. Um jedoch die Glutamatdynamik während eines Hochfrequenzbursts aufzulösen, sind schnellere Indikatoren erforderlich. Aus diesem Grund, wurden die schnellere Variante (iGluf) und die ultraschnelle Variante (iGluu), mit vergleichbarer Helligkeit, aber geringere Affinität für Glutamat entwickelt. Im Vergleich zu iGluSnFR hat iGluu eine 5-fach schnellere Kinetik in Synapsen. Ich fand heraus, dass iGluu ausreichend schnell ist, um einzelne Glutamat-Freisetzungsereignisse aufzulösen, was zeigt, dass Glutamat schnell aus dem synaptischen Spalt entfernt wird. Die Depression von iGluu-Reaktionen während 100 Hz-Zügen korreliert mit einer Depression von postsynaptischen EPSPs, was darauf hinweist, dass eine Depression während einer Hochfrequenzstimulation rein präsynaptischen Ursprungs ist. Außerdem kann ich an einzelnen Boutons feststellen, dass die Erholung von der Depression anhand der Menge an freigesetztem Glutamat im zweiten Puls vorhergesagt werden kann (gepaarte Pulserleichterung /-depression), was eine differenzielle frequenzabhängige Filterung von Spike-Trains an Schaffer-Kollateralboutons zeigt.

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