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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-96974
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9697/


Selection of Norovirus Aptamers for Food Analytical Applications

Selektion von Norovirus Aptameren zur Anwendung in der Lebensmittelanalytik

Schilling, Katja

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Aptamer , Norovirus , Lebensmittel
Freie Schlagwörter (Deutsch): SELEX
Freie Schlagwörter (Englisch): aptamer , norovirus , food , SELEX
Basisklassifikation: 35.65 , 42.13 , 42.32
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.02.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 29.04.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Das Norovirus (NoV) ist ein humanpathogenes Virus, welches zu Krankheit in allen Altersgruppen führen kann. Eine NoV Infektion verursacht vornehmlich Symptome der Gastroenteritis, einschließlich starken Erbrechens und Diarrhoe, sowie gelegentlich Fieber, Kopfschmerz und andere systemische Symptome. NoV Infektionen werden oft durch Einnahme von mit NoV kontaminierten Lebensmitteln verursacht. Die hohe Kontagiosität des Virus und die Vielfalt an Lebensmitteln, welche mit dem Virus kontaminiert sein können, stellen eine Herausforderung für die analytische Lebensmittelchemie, speziell für die Extraktion und Detektion von Viren dar. Gegenwärtige Extraktionsmethoden beruhen auf der Verwendung von speziellem Equipment zur Viruskonzentration oder der Viruspräzipitation. Im Zuge der Präzipitationsmethode verliert die Virushülle ihre Integrität und freigesetzte virale RNA wird mittels Polymerasekettenreaktion detektiert.
Der Bedarf an schnellen und unkomplizierten Norovirus Extraktionsmethoden für Vorort-Untersuchungen bei Krankheitsausbrüchen begründet die immerwährende Notwendigkeit der Entwicklung neuer Methoden die einen einfachen Nachweis des NoV in kurzer Zeit ermöglichen. Darüber hinaus sind Virusextraktionsmethoden welche eine intakte Virushülle extrahieren für bestimmte Anwendungen von Interesse, zum Beispiel für das Next Generation Sequencing. Ein Ansatz um die genannten Anforderungen zu erfüllen ist der Einsatz von sogenannten Aptameren als Extraktionsinstrument. Aptamere sind Oligonukleotid-Moleküle, welche ein Zielmolekül mit hoher Affinität und Spezifität binden. Sie werden in einem iterativen Prozess in vitro mit der Methode Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment (SELEX) selektiert. Aptamere können in einer Vielzahl von Assays und anderen analytischen Methoden benutzt werden. Als Fängermoleküle können sie an eine stationäre Phase oder an bewegliche paramagnetische Partikel gekoppelt und in Extraktionsmechanismen eingesetzt werden. Auf Basis dieser Sachverhalte ergab sich die Zielsetzung dieser Arbeit: die Evaluierung der Zweckdienlichkeit von DNA-Aptameren als Norovirus Extraktionsmoleküle in Gegenwart von Lebensmittelmatrices sowie die Entwicklung eines Aptamer-vermittelten Norovirus Extraktionsverfahren.
Einer der Vorteile der SELEX Methode ist die freie Wahl der Pufferbedingungen während der in vitro Selektion von Aptameren. Die Aptamerselektion kann daher an die nachfolgenden analytischen Parameter angepasst werden, um eine Aptamer-vermittelte Extraktion von Norovirus aus Lebensmitteln unter geeigneten Bedingungen zu erreichen. Zunächst wurde daher der Einfluss von Lebensmitteln auf die Anreicherung von Aptameren während der SELEX untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine SELEX Parallelstudie mit vier Lebensmittelmatrices durchgeführt. Als Zielmolekül für dieses SELEX diente die Norovirus P-Domäne, die am weitesten vorstehende Domäne der Norovirus Hülle. Hierfür wurde die P-Domäne in Escherichia coli rekombinant mit einem pET Expressionssystem produziert. Die Bindung zwischen selektierten Oligonukleotiden und dem SELEX Zielmolekül wurde in Gegenwart von Salzpuffer und Lebensmittelmatrices ermittelt. Die Ergebnisse dieser Vergleichsstudie suggerierten, dass eine Anreichung von Aptameren in Gegenwart von komplexen Matrices während der SELEX nicht erfolgte. Stattdessen wurde in Gegenwart der Lebensmittelmatrices eine Anreicherung von Oligonukleotiden erreicht, welche keine spezifische Bindung zur P-Domäne aufwiesen. Darüber hinaus ließen die erhaltenen Ergebnisse den Schluss zu, dass eine Aptamerselektion nicht in Gegenwart von Lebensmitteln durchgeführt werden muss, selbst wenn das resultierende Aptamer in lebensmittelanalytischen Verfahren eingesetzt werden soll. Es ließ sich weiterhin erschließen, dass ein Aptamer welches in Gegenwart von unverdünnten Lebensmittelmatrices angewendet werden soll, Eigenschaften bedarf, welche über hohe Selektivität und Affinität hinausgehen. Zu diesen Eigenschaften können vorteilhafte kinetische Bedingungen für die Bindung des Zielmoleküls, sowie die Art der Aptamer Faltung in Gegenwart des SELEX Zielmoleküls gehören.
In der in vitro Selektion in Abwesenheit von Lebensmitteln wurde das DNA-Aptamer mit dem Namen „Buf 2“ selektiert, welches eine Bindung zur Norovirus P-Domäne mit hoher Affinität (Kd: 17 ± 7 nM) und Selektivität aufwies. Die Struktur von Buf-2 wurde mittels Zirkulärer-Dichroismus-Spektroskopie abgeschätzt. Es wurde angenommen, dass es sich bei der Struktur von Buf-2 um eine parallele und antiparallele G-Quadruplex-Hybrid-Struktur handelte.
Zusätzlich wurde die Norovirus Affinität von Aptameren geprüft, welche aus publizierten SELEX Experimenten der Jahre 2013-2018, unter anderem aus dieser Arbeit hervorgegangen sind. Hierfür wurde die Bindung von sieben ausgewählten Aptameren an Virushüllen von fünf Norovirus Genotypen mittels Filterretentions-Assays, unter der Anwendung von radioaktiv markierten Aptameren evaluiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Mehrheit der getesteten Aptamere eine Affinität zum Norovirus vom Genotyp GII.4 aufwiesen. Ein Aptamer wies zusätzlich ein breites Bindungsspektrum zu anderen Genotypen auf. Die Selektivität der Virusbindung dieses Aptamers muss jedoch in weiteren Untersuchungen bestimmt werden. Nachdem die Bindung der Aptamere an die Virushüllen bestätigt wurde, konnten die Aptamere in nachfolgenden Experimenten erfolgreich in Aptamer-vermittelten „Pull-Down“ und „Dot-Blot“ Verfahren angewendet werden.
Kurzfassung auf Englisch: Norovirus (NoV) is a human pathogenic virus causing gastroenteritis and vomiting in individuals of all age groups; norovirus illness is often associated with foodborne transmission. Low viral load and the variety of food matrices which can be contaminated with the virus pose a challenge to norovirus extraction and detection. Current extraction methods are time consuming, involve specialty equipment or employ precipitation methods, breaking the viral capsid in the process. Still there is a perpetual need for rapid extraction methods that can be used in onsite outbreak investigations with low equipment requirements, where laboratory facilities are not available. Additionally, extraction methods providing intact viral particles are of interest for certain downstream applications such as next generation sequencing. The above requirements can be met by using aptamers as an extraction or detection tool. Aptamers are single-stranded nucleic acid molecules, that bind to a target, with high affinity and specificity and are selected in vitro by an iterative method called Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment (SELEX). They can be used in a variety of assay designs and can also be utilized in extraction settings if attached to a solid phase or paramagnetic particles. Hence, the fundamental objective of this study was to select, characterize and assess the utility of DNA aptamers for norovirus and its application for food analytical methods.
SELEX allows the selection of an aptamer in custom parameters, which can be tailored to inherent assay or extraction conditions. The aptamer selection conditions can therefore be adapted to the subsequent analytical parameters to achieve aptamer-mediated extraction of NoV from food. That being the case, a parallel study was conducted, investigating the influence of food matrices on aptamer enrichment during SELEX. The intention of the parallel in vitro selection, was to explore whether and how the presence of food alters aptamer selection. The norovirus protruding domain, the most extended capsid protein domain was used as SELEX target and for that purpose produced in Escherichia coli using a pET expression system. After SELEX completion, target binding of the enriched oligonucleotides in presence of food matrices was evaluated. Results of the comparative study suggest that the introduction of food to SELEX was either detrimental to enrichment of oligonucleotides with target-specific binding or facilitates enrichment of non-target-specific oligonucleotides. Moreover, a relationship between target binding of enriched oligonucleotides in presence of food and the selection condition was not observed. Results also suggest that a norovirus specific aptamer with application in food does not need to be selected in presence of the particular food but may require certain kinetic or three-dimensional properties beyond high affinity and selectivity to be applied for pathogen extraction and detection in undiluted food matrices.
The in vitro selection completed in absence of food matrices resulted in the selection of the norovirus DNA aptamer termed ‘Buf-2’ which bound the norovirus P-domain with high affinity (Kd: 17 ± 7 nM) and selectivity. The structure of aptamer Buf-2, was estimated to be a hybrid of parallel and antiparallel G-quadruplex, based on recorded circular dichroism-spectra.
Prior to investigating the utility of Buf-2 as an extraction and detection tool in aptamer-mediated pull-down and dot-blot methods, the norovirus affinity of a variety of previously identified aptamers, published between 2013 and 2015, was assessed. Additionally, NoV binding of aptamer Buf-2, generated during this work and published in 2018, was evaluated. In a comparative study, the binding of seven aptamers to the norovirus capsid protein of five norovirus genotypes was assessed by filter retention assay. The majority of these aptamers showed affinity for norovirus genotype GII.4, with the exception of one aptamer which exhibited a broad reactivity to most norovirus genotypes included in this study. The aptamers were subsequently utilized successfully in an aptamer-mediated dot-blot and pull-down assay.

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