FAQ
© 2019 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97572
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9757/


Genetische Manipulation des protozoischen Parasiten Entamoeba histolytica (SCHAUDINN, 1903) zur Charakterisierung putativer Pathogenitätsfaktoren

Lender, Sarah Corinna

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (8.171 KB) 


Freie Schlagwörter (Deutsch): E. histolytica , Pathogenitätsfaktoren , Metalloprotease , Alkoholdehydrogenase , CRISPR/Cas
Basisklassifikation: 42.36
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bruchhaus, Iris (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.05.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 23.05.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Entamoeba histolytica ist ein protozoischer Parasit und der Erreger der Amöbiasis. Warum es jedoch nur in ca. 10 % der Infektionen zu einer klinischen Manifestation in Form einer invasiven Amöbiasis und nur in 1 % der Fälle zu einer extra-intestinalen Verlaufsform kommt, ist noch unklar. Bisher wurden Cysteinproteasen, Amoebapores und das Gal/GalNAc-Lektin als wichtigste Pathogenitätsfaktoren dieses intestinalen Parasiten identifiziert. Ferner wurden vergleichende Studien zwischen verschiedenen pathogenen und apathogenen Isolaten durchgeführt, um weitere, putative Faktoren zu identifizieren, welche in die Pathogenese von E. histolytica involviert sein könnten. Darüber hinaus wurden vergleichende Transkriptomstudien von apathogenen und pathogenen Zelllinien bzw. davon abgeleiteten Klonen durchgeführt. Diese stammen von dem Isolat HM-1:IMSS ab und zeichnen sich durch einen identischen genetischen Hintergrund aus. Als Pathogenität wird hierbei die Fähigkeit der Amöben definiert, nach intrahepatischer Injektion im Tiermodell (Meriones unguiculatus und Mus musculus) einen Amöbenleberabszess (ALA) auszubilden. Die Zelllinie A konnte keinen ALA induzieren und auch die aus dieser apathogenen Zelllinie A abstammenden Klone zeigten alle denselben apathogenen Phänotyp. Dagegen zeichnen sich die Klone, welche aus der pathogenen Zelllinie B generiert wurden durch ein hoch diverses Pathogenitätsverhalten aus.
Durch die Gegenüberstellung der Transkriptomanalysen der apathogenen Klone A1np und B8np gegenüber dem pathogenen Klon B2p wurden mehrere differentiell exprimierte Gene identifiziert, wovon einige in nachfolgenden Experimenten in E. histolytica Trophozoiten überexprimiert wurden. Durch diese verstärkte Expression konnten zwei Gene identifiziert werden, deren Überexpression im pathogenen Klon B2p mit einer Reduktion der Pathogenität einherging, so dass eine inverse Korrelation zwischen dem Vorhandensein des Proteins und induzierter ALA-Bildung vorliegt.
In der vorliegenden Dissertation sollten diese beiden Proteine, eine Metalloprotease (EhMP8-2) und eine Alkoholdehydrogenase (ADH) näher charakterisiert werden. Dafür standen E. histolytica-Transfektanten zur Verfügung, in denen die entsprechenden Gene (adh und ehmp8-2) entweder überexprimiert oder gesilenct wurden, um deren Einfluss auf verschiedene Merkmale genauer zu analysieren. Die dafür verwendete Silencing-Methode basiert auf dem Prinzip der RNA-Interferenz (RNAi), bei der ein Einfluss auf Gene mit hoher Sequenzhomologie allerdings nicht auszuschließen war. Daher wurde untersucht, ob die verwendeten Silencing-Transfektanten einen Einfluss auf Gene mit Sequenzhomologie aufweisen.
Das Silencing der adh in dem apathogenen Klon B8np führte zu einem Silencing eines Gens mit 79 % Sequenzhomologie und einer signifikanten Reduktion der Expression eines Gens mit nur 56 % Sequenzhomologie. Daneben bewirkte auch das Silencing der ehmp8-2 in dem apathogenen Klon A1np eine signifikant reduzierte Expression der verwandten ehmp8-1, welche eine Sequenzhomologie von 57 % aufweist.
Aufgrund dieses relativ unspezifischen Silencings wurde versucht, das Gen-Silencing mittels CRISPR/Cas-System in E. histolytica zu etablieren. Zur Etablierung dieses Systems wurde zunächst das codierende Gen einer Cysteinprotease (EhCP-A1) ausgewählt, da einige geeignete Analysemethoden zur Verfügung stehen, um den Einfluss einer veränderten Genexpression zu untersuchen.
Als erster Ansatzpunkt wurde die Expression eines Cas9-codierenden Gens durch den Parasiten untersucht, wobei nur die Transkription und nicht die Translation bzw. Aktivität der Cas9 nachgewiesen werden konnte. Überdies wurde eine weitere Herangehensweise getestet, bei der ein Komplex in die Trophozoiten transfiziert wurde, der alle für das CRISPR/Cas-System benötigten Komponenten (rekombinante Cas9, Fluoreszenz-markierte tracrRNA und sequenzspezifische crRNA) enthielt. Mittels FACS-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie wurde bestätigt, dass dieser Komplex in die Zelle gelangt ist, aber weder die Sequenzierung noch ein Genome Editing Detection Assay lieferten ein eindeutiges Ergebnis bezüglich einer Mutation im Zielgen ehcp-a1. Auch durch die Verwendung etablierter Aktivitätstests - Substratgel und Cysteinprotease-Assay - konnte eine verminderte Aktivität des codierten Proteins EhCP-A1 nicht eindeutig nachgewiesen werden.
Es konnte demnach gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas-System in E. histolytica prinzipiell für die genetische Manipulation des protozoischen Parasiten eingesetzt werden könnte, jedoch müssten sowohl einige Parameter noch optimiert und geeignetere Methoden zur Überprüfung des Silencings etabliert werden. Aufgrund der für E. histolytica noch nicht vollständig etablierten CRISPR/Cas-Methode wurden demzufolge die putativen Pathogenitätsfaktoren (EhMP8-2 und ADH) mit den vorhandenen Silencing-Transfektanten charakterisiert, bei denen das Silencing durch RNAi erzielt wurde.
Weder die Überexpression noch das Silencing der ehmp8-2 in den Transfektanten beeinflusste die untersuchten phänotypischen Parameter Größe und Mobilität sowie die Pathogenitätsindikatoren Erythrophagozytose, Lyse und Phagozytose von THP1-Zellen. Allerdings zeigten die ehmp8-2-überexprimierenden Transfektanten in der löslichen und unlöslichen Fraktion des Lysates eine signifikant erhöhte Cysteinproteaseaktivität, während ehmp8-2-gesilencte Transfektanten eine signifikant geringere Cysteinproteaseaktivität in der unlöslichen Fraktion des Lysates aufwiesen. Zudem konnte ein Einfluss der ehmp8-2-Expression auf die hämolytische Aktivität der Transfektanten nachgewiesen werden. Die ehmp8-2-überexprimierenden Transfektanten zeigten eine signifikant erhöhte und die ehmp8-2-gesilencten Transfektanten eine signifikant reduzierte hämolytische Aktivität. Das Silencing der verwandten ehmp8-1 reduzierte ebenfalls die Fähigkeit der Transfektanten, Erythrozyten zu lysieren.
Des Weiteren konnten erfolgreich Doppel-Silencer generiert werden, in denen sowohl das codierende Gen für die EhMP8-2, als auch für die EhMP8-1 im apathogenen Klon A1np gesilenct vorliegt. Durch das Silencing beider Metalloproteasen-codierender Gene wurde die hämolytische Aktivität der Transfektanten jedoch nicht weiter reduziert als bereits durch das alleinige Silencing einer der beiden Gene. Ferner führte das Doppel-Silencing zu einer signifikant verstärkten Cysteinproteaseaktivität der löslichen Lysatfraktion der Transfektanten.
Die näheren Analysen der adh-überexprimierenden und -gesilencten Transfektanten haben gezeigt, dass das Silencing der adh zu größeren, beweglicheren Trophozoiten führte, die eine geringere Aktivität der Cysteinproteasen aufwiesen. Die Teilungsrate und die Fähigkeit zur Lyse oder Phagozytose von Erythrozyten der Transfektanten wurden weder durch die Überexpression noch durch das Silencing der adh beeinflusst. Durch Westernblot- und Immunfluoreszenzanalysen mit verschiedenen Antikörpern konnte die Lokalisation der ADH im Zytoplasma bestätigt werden. Ebenfalls wurde die ADH punktuell auf der Oberfläche der Trophozoiten nachgewiesen. Darüber hinaus konnte Formaldehyd als eins der Substrate dieser ADH verifiziert werden, da die adh-überexprimierenden Trophozoiten den Zusatz von Formaldehyd im Medium besser tolerieren konnten und eine stärkere Proliferation zeigten als die Kontrollgruppe.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die EhMP8-2 und ADH einen Einfluss auf die pathogenitätsbezogenen Eigenschaften der Trophozoiten haben. Bis jedoch ein spezifisches CRISPR/Cas-basiertes Silencing für E. histolytica etabliert ist, um die Wirkung bestimmter Gene zu identifizieren, ist das RNAi-basierte Silencing sowie klassische Überexpression von Pathogenitätsfaktoren immer noch das Mittel der Wahl, um die Pathogenitätsfaktoren von E. histolytica zu charakterisieren.
Kurzfassung auf Englisch: Entamoeba histolytica is a protozoan parasite and the causative agent of amoebiasis. However, it is still unclear why a clinical manifestation in the form of invasive amoebiasis occurs only in approximately 10 % of infections and why an extra-intestinal progression occurs only in 1 % of cases. Cysteine proteases, amoebapores and Gal/GalNAc specific lectin have been identified as the most important pathogenicity factors. Furthermore, comparative transcriptome and proteome studies of different pathogenic and non-pathogenic isolates were performed to identify further putative factors that might be involved in the pathogenesis of E. histolytica. Recently comparative transcriptome studies of non-pathogenic and pathogenic cell lines and clones with an identical genetic background which were derived from the isolate HM-1:IMSS were conducted. In this approach, pathogenicity is defined as the ability of the amoebae to induce an amoebic liver abscess (ALA) after intrahepatic injection in the animal model (Meriones unguiculatus and Mus musculus). Non-pathogenic cell line A could not induce ALA, and all clones derived from this non-pathogenic cell line A showed the same non-pathogenic phenotype. On the contrary, the clones generated from the pathogenic cell line B showed a highly diverse pathogenic behavior.
By comparing the transcriptome analysis of the non-pathogenic clones A1np and B8np with the pathogenic clone B2p, several differentially expressed genes were identified. Some of them were overexpressed in further experiments in E. histolytica trophozoites. By this increased expression two genes could be identified, whose overexpression in the pathogenic clone B2p was associated with a reduction of pathogenicity. An inverse correlation between the presence of the protein and induction of ALA formation could be observed.
In this thesis, these two proteins, a metallo protease (EhMP8-2) and an alcohol dehydrogenase (ADH), should be characterized in detail. E. histolytica transfectants in which the corresponding genes (adh and ehmp8-2) were either overexpressed or silenced were used to analyze the influence of these two genes on various parameters. The applied silencing method was based on the principle of RNA interference, but this method can influence other genes with high sequence homology, leading to an unspecific silencing. Therefore, it was tested if RNA interference has an influence on genes with a sequence homology in the silencing transfectants.
The silencing of adh in the non-pathogenic clone B8np led to a silencing of a gene with 79 % sequence homology and a significant reduction of the expression of a gene with only 56 % sequence homology. In addition, the silencing of ehmp8-2 in the non-pathogenic clone A1np caused a significantly reduced expression of the related ehmp8-1, which has a sequence homology of 57 %. Because of this more unspecific silencing, a more specific approach was needed and it was tried to establish gene silencing via the CRISPR/Cas system in E. histolytica. As a proof of principle and due to various analyzing methods available to test the influence of gene expression a cysteine protease (EhCP-A1) was selected to be silenced by CRISPR/Cas.
After introducing the Cas9 coding gene into the parasite it was possible to show that a successful transcription was achieved but not a translation of cas9. Also an activity of Cas9 could not be detected. Hence, another approach was tested in which a complex containing all components (recombinant Cas9, fluorescence labelled tracrRNA and sequence-specific crRNA) required for the CRISPR/Cas system was transfected into the trophozoites. Via FACS analysis and fluorescence microscopy it was confirmed that this complex entered the cell, but neither sequencing nor a Genome Editing Detection Assay provided a distinct result regarding a mutation in the target gene ehcp-a1. By using established activity tests - a substrate gel and cysteine protease assay - a reduced activity of the encoded protein EhCP-A1 could not be clearly detected.
It could be shown that the CRISPR/Cas system in E. histolytica could in principle be used for the genetic manipulation of the protozoan parasite but many parameters have yet to be optimized and better methods for the verification of the silencing need to be established. Due to the not yet fully established CRISPR/Cas method for E. histolytica, the EhMP8-2 and ADH were therefore characterized using the existing silencing transfectants in which silencing was achieved by RNA interference.
Neither for overexpression nor for silencing of the ehmp8-2 in the transfectants an influence on the investigated phenotypic parameters size and mobility, as well as pathogenicity indicators erythrophagocytosis, lysis and phagocytosis of THP1 cells could be shown. However, ehmp8-2 overexpressing transfectants showed in the soluble and insoluble lysate fraction a significantly increased cysteine protease activity, while ehmp8-2 silenced transfectants showed significantly lower cysteine protease activity in the insoluble lysate fraction. Interestingly, an influence on hemolytic activity could be demonstrated. It could be shown that the ability of transfectants to lyse erythrocytes was significantly increased in ehmp8-2-overexpressing transfectants and significantly reduced in ehmp8-2-silenced transfectants. The silencing of the related ehmp8-1 also leads to a reduction in hemolytic activity.
Furthermore, double silencers were successfully generated in which the coding genes for EhMP8-2 and EhMP8-1 were both silenced in the nonpathogenic clone A1np. However, the silencing of both metallo protease coding genes did not further reduce the hemolytic activity of the transfectants than the individual silencing of one of the two genes. Moreover, double silencing induced a significant increase of the cysteine protease activity of the soluble lysate fraction.
More detailed analysis of adh transfectants showed that silencing of the adh led to trophozoites being larger, proliferating faster and having lower cysteine protease activity. The division rate and the ability to lyse or phagocytose erythrocytes of transfectants were not affected by overexpression or silencing of adh. Western blot analysis as well as immunofluorescence analysis with different antibodies confirmed the localization of ADH in the cytoplasm as well as punctually on the surface of trophozoites. In addition, formaldehyde could be verified as one of the substrates of this ADH, as the adh overexpressing trophozoites tolerated formaldehyde in the medium better and showed a stronger proliferation than the control trophozoites.

To sum up, this results show that the EhMP8-2 and ADH have an impact on pathogenicityrelated characteristics of the trophozoites. But until a specific CRISPR/Cas silencing is established for the protozoan E. histolytica to identify the effect of certain genes, silencing via RNA interference or classic overexpression of pathogenicity factors is still the tool of choice to analyze the pathogenicity of E. histolytica.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende