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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97613
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9761/


Charakterisierung von Cyclophilinen aus Brassica napus und ihr Einfluss auf die Virusinfektion

Characterization of cyclophilins from Brassica napus and their influence on viral infection

Hanhart, Patrizia

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SWD-Schlagwörter: Cyclophilin , Proteine , Schmalwand <Arabidopsis> , Raps , Viren , Strukturaufklärung , Enzymaktivität , Bioinformatik , Phloem , Massenspektrometrie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Proteinreinigung , Proteinexpression , Brassica napus
Basisklassifikation: 42.41 , 42.13 , 42.03
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kehr, Julia (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.04.2019
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 31.05.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Da Pflanzen sessil sind, haben sie Strategien entwickelt, um auf abiotische und biotische Stressfaktoren reagieren zu können. Kenntnisse über diese Mechanismen sind für die Anzucht und Optimierung von Nutzpflanzen interessant, um den steigenden Bedarf an Nahrungsmitteln und Biomasse zu decken. Da Virusinfektionen für die Hälfte aller Krankheiten von Nutzpflanzen verantwortlich sind, stellen diese einen großen Faktor hinsichtlich der Produktqualität und -quantität dar. Zu einer der größten Gruppen der Pflanzenviren, den +ssRNA-Viren, gehört das Turnip mosaic virus (TuMV). Es infiziert Nutzpflanzen wie Raps (B. napus) und Rübsen (B. rapa) und nutzt das Langstreckentransportsystem Phloem für die systemische Verbreitung innerhalb des Wirts. Da CYPs ein wichtiges Ziel für die Herstellung wirksamer Medikamente gegen Virusinfektionen humaner Zellen sind, stellt sich die Frage, ob pflanzliche CYPs einen ähnlich Einfluss auf die Virusinfektion und deren systemische Verbreitung zeigen.
In dieser Arbeit führten bioinformatische Untersuchungen der B. napus Genomsequenz zur Identifizierung von 94 Genen, welche 91 unterschiedliche CYP-Proteine kodieren und damit die bisher größte CYP-Proteinfamilie darstellen. Diese große Anzahl ist auf den Ursprung von B. napus zurückzuführen und eine phylogenetische Analyse offenbarte dementsprechend in vielen Fällen zwei sehr ähnliche Isoformen. Im Rahmen weiterer in silico Analysen konnte gezeigt werden, dass BnCYPs in allen intrazellulären Kompartimenten anzutreffen sind und es in der CLD Bereiche hochkonservierter Aminosäuren gibt, welche vor allem Sekundärstrukturelemente und die Enzymaktivität aufrechterhalten.
Zum Nachweis der 91 putativen BnCYPs wurden sowohl auf Transkriptom- als auch auf Proteomebene Analysen unter normalen Wachstumsbedingungen durchgeführt. So konnte zum einen die Expression von 77 verschiedenen BnCYPs anhand einer Transkriptomanalyse bestätigt werden. Zum anderen konnte sowohl mit der 2D-Gelelektrophorese, als auch mittels LC MS/MS gezeigt werden, dass in Blatt- und Phloemproben mehrere BnCYPs vorhanden sind und diese posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen tragen können. Dass zudem eine vorhandene PPIase Aktivität im Phloemexsudat nachgewiesen werden konnte, untermauert die postulierte Hypothese zur Rolle von CYPs im Phloem, nach welcher diese als Faltungshelfer an dem Transport ungefalteter Proteine über die Plasmodesmen in das Phloem beteiligt sein könnten. Fraglich ist aber, ob die sehr ähnlichen BnCYPs in dieser Funktion redundant sind oder spezifische Interaktionspartner besitzen. Basierend auf den grundlegenden Analysen wurden deshalb mehrere Kandidaten aus dem Bereich der 18 19 kDa BnCYPs und AtCYPs für funktionelle und strukturelle Untersuchungen ausgewählt. Wie gezeigt werden konnte, besaßen alle untersuchten CYPs eine PPIase Aktivität und konnten durch CsA inhibiert werden, wobei sich sowohl die Aktivitäten als auch die Inhibitoraffinitäten nur in geringem Maß voneinander unterschieden. Zudem konnte gezeigt werden, dass BnCYP18 4 und BnCYP19 1 Disulfidbrücken bilden können. Damit könnten die BnCYPs dem für CsCYP postulierten Mechanismus zur Regulation der PPIase Aktivität folgen.
Zur Bestimmung der Struktur und deren Auswirkungen auf die Funktion wurden SAXS- und Kristallisationsversuche mit anschließender Röntgenstrukturanalyse durchgeführt. Mit SAXS konnten die ersten ab initio Modelle von CYPs generiert werden. Diese zeigten eine Ähnlichkeit in der Gesamtstruktur aller untersuchten BnCYPs und AtCYPs sowie einen bisher noch nicht beschriebenen flexiblen C Terminus. Mit der Röntgenstrukturanalyse konnte mit einer Auflösung von 1,98 Å die Kristallstruktur von BnCYP19-1 aufgelöst werden, der ersten pflanzlichen single-domain CYP Struktur der Brassicaceen. Diese bestätigte ebenfalls die insgesamt hohe Konservierung der CLD. Ein Vergleich der Kristallstruktur mit den Sequenzen der 18-19 kDa BnCYPs zeigte, dass sich Unterschiede überwiegend auf der Proteinoberfläche im Bereich von Schleifen befinden. Diese lassen vermuten, dass trotz der hohen strukturellen Konservierung eine Spezifität der Funktion bestehen könnte.
Im Rahmen der Virusinfektion durchgeführte Proteomstudien von B. napus Blatt- und Phloemproben zeigten, dass durch die TuMV-Infektion insgesamt nur sehr wenige Proteine signifikant reguliert wurden. Während im Phloem kein einziges BnCYP als signifikant reguliert identifiziert werden konnte, konnte im Blatt nur ein chloroplastidäres BnCYP, BnCYP27-3, identifiziert werden. Da die Funktion aber auch unabhängig von der Änderung der Abundanz sein kann, wurden A. thaliana Knockout- oder Knockdown-Mutanten für Stressexperimente etabliert. Hierfür wurden die T DNA-Mutanten zunächst genotypisiert, die T DNA-Insertionsstelle bestimmt und die Genexpressionsanalyse für 5 der 12 Linien fertiggestellt, sodass diese Mutanten für nachfolgende Infektionsexperimente bereitstehen. Letztendlich hat damit die Kombination verschiedener in silico, in vitro und in vivo Methoden dazu beigetragen, dass mit dieser Arbeit grundlegende Studien zur Charakterisierung der CYPs aus B. napus durchgeführt werden und erste Ansätze zur Aufklärung ihres Einflusses auf die Virusinfektion erfolgen konnten.
Kurzfassung auf Englisch: Since plants are sessile, they have developed strategies to react to abiotic and biotic stress factors. Knowledge of these mechanisms is of interest for the cultivation and optimisation of crops to meet the growing demand for food and biomass. Since virus infections are responsible for half of all crop diseases, they are a major factor concerning product quality and quantity. The Turnip mosaic virus (TuMV) belongs to one of the largest groups of plant viruses, the +ssRNA viruses. It infects crops such as rape (B. napus) and turnip (B. rapa), and uses the long-distance transport system phloem for systemic distribution within the host. As CYPs are an important target for the production of effective drugs against viral infections of human cells, the question arises whether plant CYPs have a similar effect on viral infection and its systemic spread.
In this work, bioinformatic investigations of the B. napus genome sequence led to the identification of 94 genes that encode 91 different CYP proteins and thus represent the largest CYP protein family known to date. This large number results from the origin of B. napus and indeed a phylogenetic analysis revealed in many cases two very similar isoforms. Further in silico analyses have shown that BnCYPs are localised to all intracellular compartments and that there are sections of highly conserved amino acids in the CLD that maintain secondary structure and enzyme activity.
To provide evidence for the expression of the 91 putative BnCYPs, analyses were performed at both transcriptome and proteome levels under normal growth conditions. By transcriptome analysis the expression of 77 different BnCYPs was confirmed. On the other hand, 2D gel electrophoresis as well as LC MS/MS have shown that leaf and phloem samples contain several BnCYPs, which may carry posttranslational modifications such as phosphorylations. The fact that PPIase activity could also be detected in phloem exudate supports the postulated hypothesis on the role of CYPs in the phloem, according to which they could be involved as folding helpers in the transport of unfolded proteins via plasmodesmata into the phloem. However, the question whether the very similar BnCYPs are redundant in this function or have specific interaction partners remains. Based on the basic analyses, several candidates from the 18 19 kDa range of BnCYPs and AtCYPs were selected for functional and structural investigations. As could be shown, all CYPs examined had PPIase activity and could be inhibited by CsA, and both, the activities and the inhibitor affinities, differed only slightly from each other. It has also been shown that BnCYP18 4 and BnCYP19 1 can form disulfide bridges. Thus, BnCYPs could follow the mechanism postulated for CsCYP to regulate PPIase activity.
To determine the structure and its impact on protein function, SAXS and crystallization experiments with subsequent X-ray structure analysis were performed. The first ab initio models of CYPs could be generated with SAXS. These showed a similar overall structure of all examined BnCYPs and AtCYPs as well as a flexible C-terminus not yet described. By the X-ray structure analysis, the crystal structure of BnCYP19-1, the first plant single-domain CYP structure of the Brassicaceae, could be resolved at a resolution of 1.98 Å. This also confirmed the overall high conservation of the CLD. A comparison of the crystal structure with the sequences of the 18 19 kDa BnCYPs showed that differences are predominantly found on the protein surface in the region of loops. This suggests that a specificity in function may exist despite the high structural conservation.
Proteome studies of B. napus leaf and phloem samples carried out after virus infection showed that very few proteins were significantly regulated by TuMV. While not a single BnCYP could be identified as significantly regulated in the phloem, in the leaf only BnCYP27-3 which is supposed to be located in chloroplasts could be identified. However, since protein function may be unrelated to the change in abundance, A. thaliana knockout or knockdown mutants were established for stress experiments. For this purpose, T DNA mutants were genotyped and their T DNA insertion site determined. The gene expression analysis could be completed for 5 of the 12 lines, so that these mutants are available for subsequent infection experiments. As a summary, the combination of different in silico, in vitro and in vivo methods contributed to this works basic studies on the characterization of CYPs from B. napus and enabled first approaches to elucidate their influence on virus infection.

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