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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97891
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9789/


Kardiomyozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen : Untersuchungen zur Reliabilität im 3D-Format und Anwendung als biologischer Schrittmacher

Cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells : Study of their reliability in a 3D format and their potential as a biological pacemaker

Schulze, Mirja Loreen

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Basisklassifikation: 42.13 , 44.85 , 44.39 , 44.38
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Eschenhagen, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 13.06.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierte Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten u.a. die Möglichkeit zur Patienten-spezifischen Modellierung von Krankheitsphänotypen. Inwiefern hiPSC-CMs die Gütekriterien eines Modellsystems erfüllen, ist bisher jedoch praktisch nicht systematisch untersucht worden. Das erste Projekt dieser Arbeit diente daher zur Untersuchung der Reliabilität von 3D-kultivierten hiPSC-CMs. Hierzu wurden von drei gesunden Spendern (UKEi1-UKEi3) jeweils drei Klone pro Spender und drei kardiale Differenzierungs-Batches pro Klon hergestellt und im EHT-Format (3D Engineered Heart Tissue, EHT) funktionell und auf Transkriptionsebene untersucht. Im Anschluss wurden die Tests zur funktionellen Charakterisierung auf ihre Reliabilität untersucht. Eine geringe hiPSC-Qualität beeinflusste alle Prozesse der Modellierung von Krankheitsphänotypen negativ, zu denen hiPSC-Kultur, hiPSC-Differenzierung und die funktionelle und genexpressorische Charakterisierung gehörten. Sofern hiPSC-Qualitätsstandards erfüllt waren, konnte eine geringe Variabilität in den genannten Prozessen zwischen Spendern und zwischen Klonen, aber eine vergleichsweise hohe Variabilität zwischen Batches beobachtet werden. Zur Optimierung der Reliabilität sollten daher mehrere Batches pro Spender (n≥3) analysiert werden. Die Variationskoeffizienten der verwendeten Tests waren sehr heterogen und hauptsächlich den technisch-bedingten Ebenen zuzuschreiben. Innerhalb der Testzusammensetzung zeigten die Experimente zur Calciumsensitivität und Kraft-Frequenzbeziehung die höchste Reliabilität.
Das zweite Projekt beschäftigte sich mit der Anwendung der qualitätskontrollierten hiPSC-CMs als biologischer Schrittmacher. Es wurde ein kardiales Organoid-Modell entwickelt, für das sich das arrhythmische Ratten-EHT als Substrat zu Nutze gemacht wurde, um regulär schlagende Embryoidkörperchen (EBs) als Impulsgeber zu testen (EHT+EB). Das EB zeigte eine stabile Schrittmacherfunktion im Ratten-EHT, welches ein hiPSC-CM-typisches reguläres Kontraktionsmuster aufwies. Außerdem konnte ein mit dem primären Schrittmacher des Herzens vergleichbares Kopplungsmuster visualisiert werden, weswegen das kardiale Organoid-Modell eine Möglichkeit bietet, Kopplungsprozesse für eine erfolgreiche Schrittmacherfunktion in vitro zu studieren.
Kurzfassung auf Englisch: Due to the lack of systematic studies questioning quality criteria associated with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) modeling human disease phenotypes, the first project of this thesis aimed at analyzing reliability of 3D-cultured hiPSC-CMs. For this, three healthy donors were chosen (UKEi1-UKEi3) of which three clones/donor and three cardiac differentiation batches/clone were generated and analyzed in 3D engineered heart tissue (EHT). Analysis included gene expression profiles and functional cardiac parameters associated with cardiomyopathies. Tests for functional characterization were also analyzed for reliability. A high impact of low hiPSC quality could be observed for all processes involved in hiPSC disease modeling, including hiPSC culture, hiPSC differentiation, functional characterization and the transcriptome. If hiPSCs fulfilled quality standards like exhibiting a normal karyotype and high pluripotency, little variability was seen for disease modeling processes between healthy donors and clones. However, batches depicted a high level of variability wherefore it is suggested to analyze at least three batches per donor. The separation of biological from technical variability allowed for UKEi1 to link functional calcium handling characteristics with a lower expression in calsequestrine (CASQ2), a calcium binding protein from the sarcoplasmic reticulum. The variation coefficients of the used tests for functional characterization were highly heterogenic and mainly associated with levels of technical variability (EHT/repetition/unexplained, clone, batch). Within the test pool, experiments analyzing calcium sensitivity and force frequency relationship showed highest reliability.
Next to the possibility of using hiPSC-CMs for disease modeling studies another application may be their use for regeneration purposes. Accordingly, the second project analyzed the potential of regular beating hiPSC-CMs to act as a biological pacemaker. For this, embryonic body (EB) cultured hiPSC-CMs were used as a trigger to pace arrhythmic beating rat EHTs as substrate. This cardiac organoid model showed that the EB indeed was capable of pacing rat EHTs in a regular and stable way. Furthermore, a coupling pattern comparable to the primary pacemaker of the heart could be observed which makes EHTs+EB a good in vitro model to study coupling processes necessary for successful action potential propagation.

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