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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97960
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9796/


Bedeutung von Integrin β4 und E-/P-Selektin für dasTumorwachstum im Prostatakarzinom-Xenograftmodell

Importance of integrin β4 and E-/P-selectin for tumor growth in the prostate carcinoma xenograft model

Schetler, Daniela

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SWD-Schlagwörter: Krebs <Medizin> , Prostatakrebs
Basisklassifikation: 44.34
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Lange, Tobias (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 14.06.2019
Kurzfassung auf Deutsch: In einem vorausgegangenen Projekt konnte nachgewiesen werden, dass Prostatakarzinom- (PCa-)Zellen bei Abwesenheit endothelialer Selektine (in E/P-Selektin-KO-Mäusen) metastasieren können und bei besonders hoher metastatischer Kompetenz spezifisch das β4-Integrin (ITGB4) heraufregulieren.
Daraufhin wurde ITGB4 in den hoch metastatischen PC-3-Zellen depletiert und die Auswirkung dieses ITGB4-knockdowns (KD) auf Tumorwachstum und Metastasierung im Xenograftmodell in WT- und E-/P-Selektin-knockout (KO)-Mäusen untersucht. Der ITGB4-KD allein führte bereits zu einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums. Bei Kombination des ITGB4-KD mit dem E-/P-Selektin-KO war das Tumorwachstum jedoch nahezu vollständig aufgehoben, während der Selektin-KO allein gar keinen Effekt auf das Tumorwachstum hatte. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Mechanismen, die diese Beobachtung zugrunde liegen. Es wurde untersucht, ob die, durch den ITGB4-KD ausgelöste Wachstumsverzögerung durch eine verminderte Proliferation oder gesteigerte Apoptose bedingt war.
Durch verschiedene Nachweismethoden konnte eine gesteigerte Apoptose in den ITGB4-KD-Tumoren gezeigt werden. Aufgrund der physiologischen Funktion von ITGB4 wurde vermutet, dass es sich dabei um die Sonderform der Anoikis handelt. Da die Tumore nach alleinigem ITGB4-KD zwar verzögert, aber letztlich doch noch wuchsen, schien eine gewisse Resistenzentwicklung gegen die Anoikis in diesen Tumoren abzulaufen, was sich anhand einer RAF/MEK-unabhängigen Induktion der MAPK-Aktivität und erniedrigten ERK/p38MAPK-Ratio andeutete. Zur Erklärung des synergistischen Effektes aus ITGB4-KD und Selektin-KO entstand daher die Hypothese, dass die für das Wachstum von ITGB4-KDTumoren erforderliche Anoikis-Resistenzentwicklung bei gleichzeitigem Fehlen von E-/P-Selektin im umliegenden Stroma nicht mehr möglich ist. Als mögliche Ursache wurde angenommen, dass sich der Selektin-KO durch eine Verringerung der Immunzell-Infiltration des Tumors auswirkt, was zu einer Veränderung des intratumoralen Chemokinmilieus führen könnte. Eine Analyse der PC-3-Zellen hinsichtlich ihrer Chemokinrezeptor-Expression konnte die Expression von CXCR4 zeigen, dessen Ligand SDF-1α ist. Folglich konnte nachgewiesen werden, dass die Selektindefizienz und unabhängig davon überraschend auch die ITGB4-Depletion den SDF-1α-Gehalt in den Xenografttumoren verringert.
Die Auswirkung von SDF-1α auf die Tumoretablierung wurde mit Hilfe von colony formation assays analysiert. Der ITGB4-KD führte zu deutlich weniger und kleineren Kolonien als. Sowohl die exogene Zufuhr von rmSDF-1α als auch die Zugabe von konditioniertem Medium (CM) von ITGB4-positiven Kontrollzellen konnte die Kolonienbildung spezifisch von ITGB4-depletierten PC-3-Zellen steigern. Der
Kolonien-fördernde Effekt des PC-3-shControl-CM konnte durch einen neutralisierenden SDF-1α-Antikörper reduziert werden. Daraus folgt, dass ITGB4-depletierte Tumorzellen bei der Anoikis-Resistenzentwicklung aufgrund einer verringerten endogenen SDF-1α-Produktion auf die exogene Zufuhr von SDF-1α, z. B. aus tumorassoziierten Leukozyten (TALs), angewiesen sind. Zudem wurde festgestellt, dass der ITGB4-KD und der Selektin-KO jeweils zu einer verminderten Aktivität von SRC und JNK führt, so dass bei Konvergenz beider Veränderungen ein kritisches level an Aktivität dieser Kinasen unterschritten werden könnte. Die TALs könnten über die SDF-1α-CXCR4-Achse einen alternativen Signalweg zum fehlendem Integrin-Signalling aktivieren und der Zelle die Fähigkeit zur Anoikis-Resistenzentwicklung verleihen.
Kurzfassung auf Englisch: The previous data leading to this work demonstrated that human prostate cancer (PCa) cells can metastasize in the absence of endothelial selectins (by using E-/P-selectin knockout (KO) mice in xenograft models) and specifically upregulate β4 integrin (ITGB4) when they are highly metastatic.
ITGB4 was then depleted in the PCa cell line PC-3 and the effect of this ITGB4 knockdown (KD) on tumor growth and metastasis was investigated in WT and E-/P-selectin KO mice. The ITGB4-KD alone already led to a significant delay in tumor growth. However, when ITGB4-KD was combined with E-/P-selectin KO, tumour growth was almost completely eliminated, while selectin-KO alone had no effect at all on tumor growth. The aim of this work was to investigate the underlying mechanisms of this observation. It was investigated whether the growth delay induced by ITGB4-KD was due to reduced proliferation or increased apoptosis. By different detection methods an increased apoptosis could be shown in the ITGB4-KD tumors. Due to the physiological function of ITGB4 (cell-matrix contact), it was suspected that the increased apoptosis was due to anoikis (‘homelessness’-induced apoptosis). Since the tumor growth was indeed delayed after ITGB4-KD, but ultimately still grew, a certain resistance against anoikis seemed to develop. This suspicion could be substantiated by means of RAF/MEKindependent induction of MAPK activity and decreased ERK/p38MAPK ratio determined in the xenograft tumors. In order to explain the synergistically reduced tumor growth after combined ITGB4-KD and selectin KO, the resulting hypothesis was therefore that anoikis resistance is impaired, when E-/Pselectin are absent in the surrounding stroma. As a possible explanation, it was assumed that the selectin KO caused reduced immune cell infiltration of the tumor, which could lead to a change in the intratumoral chemokine environment. An analysis of the PC-3 cells with regard to chemokine receptor expression demonstrated notable expression of CXCR4, whose ligand is SDF-1α. Consequently, it could be demonstrated that selectin deficiency and, to our surprise, also ITGB4 depletion both reduced the intratumoral SDF-1α concentration. The effect of SDF-1α on tumor establishment was analyzed using colony formation assays. The ITGB4-KD led to significantly less and smaller spheroid colonies in soft agar. Both the exogenous supply of rmSDF-1α and the addition of conditioned medium (CM) of ITGB4-positive control cells could specifically increase the colony formation of ITGB4-KD PC-3 cells. The colony-promoting effect of PC-3-shControl-CM was reduced by a neutralizing SDF-1α antibody.
Based on these results, it was concluded that ITGB4-depleted tumor cells may depend on the exogenous supply of SDF-1α, e. g. from tumor-associated leukocytes (TALs), for anoikis resistance development due to reduced endogenous SDF-1α production. In addition, it was found that the ITGB4-KD and the selectin-KO each led to a reduced activity of SRC and JNK, so that if both changes converge, the activity of these kinases could fall below a critical level. The TALs could activate the SDF-1α-CXCR4 axis to compensate the lost integrin signaling, which might enable the tumor cells to develop anoikis resistance.

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