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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-98251
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9825/


The effects on the malaria parasite Plasmodium falciparum (WELCH, 1897) in response to an interaction of parasitized erythrocytes with various human endothelial receptors

Effekte auf den Malariaerreger Plasmodium falcipraum (WELCH, 1897) als Reaktion auf die Interaktion parasitierter Erythrozyten mit verschiedenen menschlichen Endothelrezeptoren

Roth, Lisa Katharina

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Freie Schlagwörter (Deutsch): TNFR1 , TNFR2 , MDR1 , CD37 , CD81 , CD55
Freie Schlagwörter (Englisch): receptor , sequestration , adhesion , knobs , Plasmodium , falciparum , NGS , TEM
Basisklassifikation: 42.15 , 42.36 , 42.13 , 44.44
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bruchhaus, Iris (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.05.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 01.07.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Malaria ist nach wie vor eine der Hauptinfektionskrankheiten weltweit, wobei Plasmodium falciparum die schwerste Form auslöst. Diese ist durch die Ausprägung verheerender klinischer Symptome charakterisiert, wie beispielsweise hämolytische Anämie, Blockierung des Blutflusses, kritische und unzureichende Versorgung von Organen, sowie massive Hirnschädigungen und Tod.

Variable Oberflächenproteine, wie 'Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1' (PfEMP1) und andere Multigenfamilien sind an der Interaktion zwischen dem Malariaerreger und seinem menschlichen Wirt beteiligt. Die PfEMP1 Proteine sind in hoher Dichte in und um knopfförmige Ausstülpungen, den sogenannten knobs, auf der Membranoberfläche von infizierten Erythrozyten (IE) zu finden. Insbesondere die beiden parasitären Mechanismen der Sequestrierung und die antigene Variation sind für die Immunabwehr und das Überleben des Parasiten im Wirt wichtig. Diese werden vor allem durch PfEMP1 und weitere Oberflächenproteine vermittelt und stellen somit die Hauptfaktoren für die hohe Pathogenität von P. falciparum dar. Inzwischen wurden einige menschliche Rezeptoren identifiziert, die an der Sequestrierung der IE beteiligt sind. Allerdings konnten bisher nur für einige von ihnen PfEMP1 als Parasitenligand identifiziert werden.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Genexpression verschiedener P. falciparum Populationen zu analysieren, die spezifisch auf die Bindung an verschiedene humane Endothelrezeptoren angereichert wurden.

Mit Hilfe von statischen Bindungsexperimenten diverser P. falciparum Kultur- und Feldisolate wurde die anfängliche Bindungsfähigkeit der Isolate bewertet. Diese zeigten bemerkenswerte Bindungsprofile hinsichtlich sechs, bislang nicht, oder nur kaum beschriebener, vielversprechender Rezeptoren, nämlich MDR1, TNFR1, TNFR2, CD37, CD55 und CD81.

Darauf aufbauend wurde das P. falciparum IT4 Isolat mittels spezifischer Bindungsstudien auf die entsprechenden Rezeptoren angereichert und durch eine nachfolgende Genexpressionsanalyse via next generation RNA-Sequenzierung analysiert. Für jede einzelne der IT4 Population wurden die var Multigenfamilie sowie andere Gruppen von Oberflächenproteinen untersucht und eine umfassende Auswertung der gesamten Transkriptome durchgeführt.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen eine erhöhte Expression in fast allen rezeptorspezifisch angereicherten IT4 Populationen. Eine differenzielle Expression der var Gene konnte in IT4-MDR1 für C_var05; in IT4-TNFR1 für A_var03; in IT4-CD55 für B_var11 und in IT4-CD81 für A_var09, B_var11 und B_var12 beobachtet werden. Darüber hinaus wurden hauptsächlich in den IT4-MDR1, IT4-TNFR2, IT4-CD37 und IT4-CD81 Populationen erhöhte Genexpressionen detektiert, deren Proteine mit der Ausbildung von knobs auf der Oberfläche von IE in Verbindung gebracht werden.

Die quantitative und vergleichende Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) lieferte einen Überblick über die Morphologie der untersuchten IT4 Populationen. Diese wurden entweder durch spezifische, rezeptorvermittelte Sequestrierung oder durch Kultivierung in Gegenwart von Hitzestress generiert. Hierbei wurde insbesondere das Vorhandensein von knobs innerhalb der verschiedenen Populationen analysiert. Zusätzlich wurde ein Vergleich mit unterschiedlichen P. falciparum Feldisolaten angestellt.

Die TEM-Analyse zeigte einen knob positiven Phänotyp innerhalb der IT4-CD37 und einer kleineren IT4-CD81 Populationen. Zudem bewirkte die Sequestrierung an humane Gehirnendothelzellen bei fieberartigen Temperaturen ebenfalls eine knob Ausprägung auf den IE. Überraschenderweise prägte sich dieser Phänotyp auch in geringem Maße in bestimmten IT4-Populationen aus, welche spezifisch an Mock-transfizierte CHO-GFP sowie an CHO-CD55 Zellen sequestrierten, die das menschliche CD55 Protein auf der Oberfläche exprimieren. Dies konnte jedoch nur in Kombination mit kurzen, fieberartigen Temperaturphasen erzielt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gruppe an P. falciparum IE interagierenden Rezeptoren erweitert und gleichzeitig Hinweise auf das Zusammenspiel mit bestimmten PfEMP1 Proteinen gefunden wurden.
Außerdem ist der Einfluss von Fieber, im Zusammenspiel mit Sequestrierung besonders zu beachten. Die gewonnenen Erkenntnisse eröffnen neue Möglichkeiten für weitere Untersuchungen hinsichtlich der wesentlichen Pathogenitätsfaktoren von P. falciparum, um so neue Strategien zur Bekämpfung der Malaria zu entwickeln.
Kurzfassung auf Englisch: Malaria is still one of the main infectious diseases worldwide, while Plasmodium falciparum induces the most severe form, with a high potential of developing devasting clinical symptoms such as hemolytic anemia, obstruction of blood flow, critical and insufficient supply of organs as well as cerebral impairment and death.

Variable surface proteins, such as 'Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1' (PfEMP1) and other multicopy gene families, are involved in the interaction between the malaria pathogen and its human host. PfEMP1 appears in electron dense structures, termed knobs, on the membrane of infected erythrocytes (IE). In particular, the parasitic mechanisms of sequestration and antigenic variation are crucial for immune evasion and parasite survival. They are mainly mediated by PfEMP1 and other surface proteins, thus, the proteins being the major factors for the high pathogenicity of P. falciparum. By now, various human receptors are known to bind IE but only for a few of them, PfEMP1 is identified as the parasite ligand.

The overall objective of this work was to characterize the gene expression of P. falciparum populations, specifically enriched for binding to different human endothelial receptors.

By conducting static binding assays with various P. falciparum culture and field isolates, the initial binding capability of the isolates was evaluated. This revealed a noteworthy binding profile towards 6 promising, so far, only barely if yet described candidates, namely MDR1, TNFR1, TNFR2, CD37, CD55 and CD81.

Consequently, the P. falciparum IT4 isolate was utilized for specific sequestration studies, followed by a respective gene expression analysis via next generation RNA sequencing. For each individual and receptor specifically enriched IT4 population, the var multigene family as well as other multicopy surface protein clusters were evaluated, while a comprehensive analysis of the whole transcriptomes was performed in the same course.

The obtained results evidenced a differentially upregulation in almost all receptor enriched IT4 populations. The expression of particular var genes was observed in IT4- MDR1 for C_var05; in IT4-TNFR1 for A_var03; in IT4-CD55 for B_var11 and in IT4-CD81 for A_var09, B_var11 and B_var12. Furthermore, diverse gene clusters, associated with knob formation on the surface of IE were cumulatively detected in IT4-MDR1, IT4-TNFR2, IT4-CD37 and IT4-CD81. The gene, coding for the major knob associated histidine rich protein (KAHRP), was found to be extensively upregulated in the IT4-CD37 population, while also being present at considerable levels in IT4-MDR1, IT4-CD55 and IT4-CD81.

The quantitative and comparative transmission electron microscopy (TEM) analysis provides an overall view of the morphology, appearance and versatility of distinct P. falciparum populations. While exhibiting a definite binding profile towards the particular human receptors as well as cultivated under various febrile conditions, the appearance and distribution of knob formations were focused on. Moreover, a comparison of various P. falciparum field isolates was performed.

The TEM analysis revealed a knob positive phenotype apparent within the IT4-CD37 and, in smaller proportions, in the IT4-CD81 population. Additionally, the sequestration towards human endothelial brain cells at febrile temperature manifested knob positive IE. Surprisingly, this phenotype was also achieved within small IT4 populations, specifically sequestered to mock-transfected CHO-GFP as well as to CHO cells expressing human receptor protein CD55, in combination with short periods of febrile temperatures.

Summarizing, the as yet described set of human receptors, interacting with P. falciparum infected erythrocytes can be extended, while also a hint towards the interacting PfEMP1 proteins has been revealed. Eventually, the influence of febrile temperatures coupled with sequestration, must be noted. The obtained findings open up new possibilities for further investigations regarding major factors of the high pathogenicity of P. falciparum, to get a step closer to fight malaria.

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