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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-99598
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9959/


Untersuchungen zur Funktion der Inositol-5-Phosphatase SHIP1 für die Pathogenese von Hauttumoren

Studies on the function of the inositol-5-phosphatase SHIP1 for the pathogenesis of skin tumors

Drechsel, Oliver

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SWD-Schlagwörter: Hauttumor , Inosite , Tumor , Pathogenese
Freie Schlagwörter (Deutsch): SHIP1 , Inositol-5-Phosphatase
Freie Schlagwörter (Englisch): SHIP1 , inositol-5-phosphatase
Basisklassifikation: 44.81
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Jücker, Manfred (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.08.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 05.09.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)/Akt-Signalweg dient der Regulation der Proliferation, des Wachstums, der Migration und des Überlebens von Zellen. In Krebszellen findet man häufig eine konstitutive Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges durch aktivierende Mutationen im PI3K-Gen PIK3CA oder durch inaktivierende Mutationen von Negativregulatoren wie z.B. der Phosphoinositid-3-Phosphatase PTEN („loss of function“). Im Gegensatz zu PTEN können Inositol-5-Phosphatasen wie SHIP2 und Synaptojanin2, die PI(3,4,5)P3 zu PI(3,4)P2 umwandeln, sowohl als Onkogen als auch als Tumorsuppressor wirken. Für die Inositol-5-Phosphatase SHIP1, die normalerweise nur in hämatopoetischen Zellen exprimiert wird, konnte bisher nur eine Funktion als Tumorsuppressor in der Leukämogenese gezeigt werden. In unserer Arbeitsgruppe konnte jedoch eine ektope Expression von SHIP1 in bis zu 50% der untersuchten Patienten bei verschiedenen Tumorentitäten und so auch bei 14% der untersuchten primären Melanome nachgewiesen werden. Zusätzlich findet man in der COSMIC-Datenbank eine Mutationsrate im SHIP1-Gen (INPP5D) von 5,9% in Melanomen. In der vorliegenden Arbeit wurde nun untersucht, ob enzymatisch aktives SHIP1 in Melanomzellen exprimiert wird und welche biologischen Auswirkungen die ektope Expression von SHIP1-Wildtyp sowie die von Patienten-abgeleiteten SHIP1-Mutationen in Melanomzellen hat. Die SHIP1-Mutante R673Q konnte bei einem Patienten mit einem malignen Melanom isoliert werden, während die SHIP1-Mutante Y643H bei einem Patienten mit einer akuten myeloischen Leukämie nachgewiesen wurde. Mittels Westernblot konnte SHIP1 in 1 von 7 untersuchten Melanomzelllinien (WM1366) auf Proteinebene detektiert werden, was einem Prozentanteil von 14,3% entspricht, während in normalen Melanozyten von 4 gesunden Spendern keine SHIP1-Expression detektiert werden konnte. Mittels eines Inositol-5-Phosphatase-Assays konnte eine enzymatische Aktivität des in den WM1366 exprimierten SHIP1 nachgewiesen werden, die gegenüber dem SHIP1-Wildtyp um das 2,3-fache erhöht ist.
Zur Untersuchung der Wirkung von SHIP1 auf Melanomzellen wurden die 3 Melanomzelllinien MV3, WM164 und WM793 als Modellsysteme verwendet und SHIP1 sowie die beiden SHIP1-Mutanten SHIP1-Y643H und SHIP1-R673Q mittels lentiviraler Transduktion stabil ektop exprimiert und analysiert.
Die Überexpression von SHIP1-Wildtyp führte in zwei der drei untersuchten Melanomzelllinien zu einer signifikanten Hemmung der Proliferation, sowie in der Zelllinie WM793 zu einer reduzierten Invasion im Kollagen-Invasions-Assay, während SHIP1

unterschiedliche Effekte in den drei Melanomzelllinien im Boyden-Chamber-Assay auf die Migration zeigte. SHIP1-WT führte zu einer signifikanten Hemmung der Phosphorylierung von AKT in einer der drei untersuchten Melanomzelllinien (WM793).
Die Untersuchung der beiden SHIP1-Mutanten ergab in einem Inositol-5-Phosphatase-Assay für die SHIP1-Mutante Y643H eine enzymatische Restaktivität von 17,1%, während bei der SHIP1-Mutante R673Q ein vollständiger Verlust der Enzymaktivität gemessen wurde. Es konnte sowohl im Zellzählversuch, im Alamar-Blue-Assay als auch im Bromdesoxyuridin-Assay eine durch die SHIP1-Mutanten Y643H und R673Q bedingte Zunahme der Proliferation sowie mittels Boyden-Chamber-Assay eine Steigerung der Migration gegenüber SHIP1-Wildtyp in allen drei untersuchten Melanomzelllinien beobachtet werden. In den Melanomzelllinien MV3 und WM793 konnte ein durch die Expression der SHIP1-Mutante Y643H induzierter erhöhter Phospho-Akt-Spiegel gegenüber SHIP1-WT beobachtet werden. Ebenfalls zeigte sich im Kollagen-Invasions-Assay eine Zunahme der Invasion in den mit den SHIP1-Mutanten transduzierten Zellen der Melanomzelllinie WM793 gegenüber den mit SHIP1-Wildtyp transduzierten Zellen. Da SHIP1 PI(3,4,5)P3 an der 5´-Position des Inositolringes dephosphoryliert und somit zu PI(3,4)P2 umwandelt, könnte PI(3,4,5)P3 durch „substrate trapping“ von SHIP1-Mutanten mit verminderter enzymatischer Aktivität gebunden und so vor dem Abbau geschützt werden, was die in dieser Arbeit beobachtete Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges nach Expression der SHIP1-Mutante Y643H mit stark reduzierter Enzymaktivität erklären könnte. Im Einklang mit diesem Modell konnte in allen drei untersuchten Melanomzelllinien durch Membranfraktionierung eine erhöhte Membranlokalisation von SHIP1Y643H im Vergleich zu SHIP1-WT gezeigt werden.
Durch Hemmung des PI3K-Akt-mTOR-Signalweges mit dem Inhibitor MK2206 gegen Akt und Rad001 gegen mTOR, konnte die Proliferation der beiden untersuchten Melanomzelllinien MV3 und WM164 partiell gehemmt werden, wobei die Kombinationstherapie mit beiden Hemmstoffen synergistische Effekte zeigte. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Hemmung des Wachstums von Melanomzellen mit AKT- und mTOR-Inhibitoren müsste in weiterführenden präklinischen Experimenten im Mausmodell auf eine mögliche therapeutische Wirkung hin weiter untersucht werden.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass SHIP1 einen wichtigen Regulator des PI3K-Akt-mTOR-Signalweges in Melanomzellen darstellt und SHIP1-Wildtyp eine Rolle als Tumorsuppressor innehat, während SHIP1-Mutanten mit reduzierter enzymatischer Restaktivität in Melanomzellen als Onkogene fungieren könnten, was in einem Xenograft-Mausmodell weiterführend untersucht werden sollte.
Kurzfassung auf Englisch: The phosphoinositide-3-kinase (PI3K) / Akt signaling pathway regulates the proliferation, growth, migration and survival of cells. In cancer cells a constitutive activation of the PI3K / AKT signaling pathway by activating mutations in the PI3K gene (PIK3CA) or by inactivating mutations of negative regulators, e.g. phosphoinositide-3-phosphatase PTEN (loss of function) can often be observed. In contrast to PTEN, inositol 5-phosphotases such as SHIP2 and synoptajanin2, which convert PI (3,4,5) P3 to PI (3,4) P2, can act both as an oncogene as well as a tumor suppressor. For the inositol 5-phosohatase SHIP1, which is normally only expressed in hematopoietic cells, only a role as a tumor suppressor in leukemogenesis has been shown. In our group, however, ectopic expression of SHIP1 was detected in different tumor entities in up to 50% of the patients studied and in 14% of the investigated primary melanomas. In addition, in the COSMIC database a mutation rate of 5.9% in the SHIP1 gene (INPP5D) can be observed in melanomas. In the present work, it was investigated whether enzymatically active SHIP1 is expressed in melanoma cells and which biological effects ectopic expression of SHIP1 wild-type and patient-derived SHIP1 mutations have on melanoma cells. The SHIP1 mutant R673Q was isolated in a patient with malignant melanoma, while the SHIP1 mutant Y643H was detected in a patient with acute myeloid leukemia.
Using Western blot, SHIP1 could be detected at the protein level in 1 out of 7 investigated melanoma cell lines (WM1366), which corresponds to a percentage of 14.3%, whereas in normal melanocytes of 4 healthy donors no SHIP1 expression could be detected. By means of an inositol 5-phosphatase assay, the enzymatic activity of SHIP1 expressed in the melanoma cell line WM1366 could be determined to be 2.3 times higher than the SHIP1 wild type.
To investigate the effect of SHIP1 on melanoma cells, the 3 melanoma cell lines MV3, WM164 and WM793 were used as model systems and SHIP1 as well as the two SHIP1 mutants SHIP1-Y643H and SHIP1-R673Q were stably ectopically expressed by lentiviral transduction and analyzed.
Overexpression of wild-type SHIP1 resulted in a significant inhibition of proliferation in two of the three melanoma cell lines tested, as well as a reduced invasion in the collagen invasion assay in the WM793 cell line, whereas SHIP1 had different effects on migration in the three boyden chamber assays. SHIP1 wild type resulted in a significant inhibition of AKT phosphorylation in one of the three melanoma cell lines studied (WM793). Examination of the two SHIP1 mutants revealed 17.1% residual enzymatic activity in an inositol 5-phosphatase assay for the SHIP1 mutant Y643H, while a complete loss of enzyme activity

was measured in the SHIP1 mutant R673Q. In the cell counting, the alamar blue assay and the bromodeoxyuridine assay, an increase in proliferation due to the SHIP1 mutants Y643H and R673Q as well as an increase in migration over the wild-type SHIP1 in all three studied melanoma cell lines could be observed in the boyden chamber assay. In the melanoma cell lines MV3 and WM793, an increased phospho-Akt level induced by the expression of the SHIP1 mutant Y643H was observed in comparison with SHIP1 wild type. There was also an increase in invasion in the collagen invasion assay in the WM793 melanoma cells transduced with the SHIP1 mutants versus the cells transfected with SHIP1 wild-type.
SHIP1 dephosphorylates PI(3,4,5)P3 at the 5'-position of the inositol ring and thus converts it to PI(3,4)P2. Mutants with reduced enzymatic activity can bind to PI(3,4,5)P3 and, thus, protected it from degradation due to its reduced enzymatic activity (substrate trapping), which could explain the results observed in this work such as the elevated phospho-Akt level after transduction with the enzymatically restricted SHIP1 mutant Y643H.
In accordance with this model, membrane fractionation revealed an increased membrane localization of SHIP1-Y643H compared to SHIP1-WT in all three investigated melanoma cell lines.
By inhibition of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway with the Akt inhibitor MK2206 and the mTOR inhibitor Rad001, the proliferation of the two investigated melanoma cell lines MV3 and WM164 could be partially inhibited. Therapy with the combination of both inhibitors showed synergistic effects. This observed inhibition of growth in melanoma cells requires further investigation on a possible therapeutic use in additional preclinical experiments such as a mouse model.
The results suggest that SHIP1 is an important regulator of the PI3K-Akt mTOR pathway in melanoma cells and that SHIP1 wild type plays a role as a tumor suppressor, whereas SHIP1 mutants with reduced residual enzymatic activity could function as oncogenes in melanoma cells. These results should be further investigated in a xenograft mouse model.

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