Analysis of microtubule-podosome contacts and the impact of INF2, KANK1 and Drebrin

Abstract

Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der schrittweisen Entwicklung des Software-basierten Programmes „ContactAnalyzer“ und dessen erfolgreicher Anwendung zur Untersuchung und Quantifizierung der intrazellulären Kontakte zwischen Podosomen und Mikrotubuli-Plus-Enden. Podosomen sind Aktin-reiche, funktionell sehr vielfältige Adhäsionsstrukturen vieler Zellsysteme und werden in den hier untersuchten primären humanen Makrophagen spontan in großer Zahl gebildet. Sie haben eine dreigeteilte Struktur mit einem Aktinkern, einem adhäsiven Ring aus Plaque-Proteinen wie Vinculin und einer Kappe die sich z.B. durch Proteine wie α-Actinin auszeichnet. Um neben der Adhäsion auch ihre weiteren Funktionen, wie die Degradation von extrazellulärer Matrix durchführen zu können, benötigen Podosomen lytische Enzyme wie die membranständige Matrixmetalloprotease MT1-MMP. Der Transport dieser Enzyme in Vesikeln wird über Mikrotubuli, einer weiteren Zytoskelettkomponente, bewerkstelligt. Es konnte beobachtet werden, dass das Kontaktieren von Mikrotubuli-Plus-Enden an Podosomen Auswirkungen auf deren Dynamik hat. Bisher wurde jedoch keine genaue Analyse dieser Kontakte angefertigt, im Speziellen nicht der Einfluss verschiedener Podosomenkomponenten auf diese Interaktionen. Zunächst wurden acht verschiedene Proteine als potentielle Kandidaten ausgewählt, die eine Rolle für die Kontakte oder deren Regulation spielen könnten. Hierzu zählen inverted formin 2 (INF2), lymphocyte-specific protein 1 (LSP1), supervillin (SV) als bekannte Kappenproteine sowie drebrin (DBN), welches im Rahmen dieser Arbeit als Kappenprotein identifiziert wurde. Die Podosomen-Kappe könnte durch ihre exponierte Position ein vielversprechendes Ziel für Mikrotubuli sein. Weiter wurde ein Protein des Ringes, p21-activated kinase 4 (PAK4) sowie ein Podosomen-assoziertes Protein IQ motif containing GTPase-activating protein 1 (IQGAP1) in die Analyse mit einbezogen. Für beide Proteine wurden Interaktionen mit Aktin bzw. Mikrotubuli gezeigt, daher sollte untersucht werden, ob sie auch einen Einfluss auf die Kontakte zwischen Podosomen und Mikrotubuli haben. Die zwei abschließenden Kandidaten KN motif and ankyrin repeat domain-containing protein 1 (KANK1) und protein rich in the amino acids E, L, K and S (ELKS) sind Teil eines Komplexes, der Mikrotubuli Kortex-nah stabilisiert, dem sogenannten cortical microtubule stabilization complex (CMSC) und daher ebenfalls potentiell an der Regulation von Podosom-Mikrotubuli-Kontakten beteiligt. Zunächst wurde ein Software-basiertes Auswertungsprogramm „ContactAnalyzer“ entwickelt und validiert, um Lebendzellaufnahmen zu analysieren. Dieses verwendet Koordinaten von Podosomen und Mikrotubuli, um festzustellen, ob ein Kontakt stattfindet und wie lange dieser andauert. Außerdem können weitere Parameter wie Podosomen- und Mikrotubulianzahl und Podosomen-Lebenspanne ausgewertet werden. In dieser Arbeit wurden vorbereitend 3 Mikrotubuli-Plus-Enden (+TIP)-Marker untersucht, wobei das EB3 (end binding protein 3) den geringsten Einfluss auf die Anzahl der Podosomen, Anzahl der Mikrotubuli-Plus-Enden sowie die Kontaktanzahl zwischen diesen beiden zeigte. Um den Einfluss der Podosomenkomponenten besser einschätzen zu können, wurde daher dieser Marker für alle folgenden Analysen gewählt. Nach der Auswahl der zu untersuchenden Podosomenkomponenten, wurde zunächst die Effizienz und der Einfluss ihrer siRNA basierten Depletion auf die allgemeine Zell- und Podosomencharakteristik untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass für die meisten Depletionen der Kandidatenproteine keine signifikante Änderung in Zellgröße, Podosomenanzahl, -durchmesser oder -dichte zu beobachten sind. INF2-depletierte Zellen wiesen eine etwas geringere Größe und Anzahl von Podosomen auf, wodurch die Podosomendichte unverändert blieb. KANK1-depletierte Zellen zeigten eine verringerte Podosomendichte bei leicht erhöhtem Podosomendurchmesser. Nach diesen vorbereitenden Analysen wurde die Auswirkung der Depletion einzelner Kandidatenproteine auf das Kontaktverhalten und Kontaktcharakteristika untersucht. Hier konnte im Vergleich zur Kontrolle gezeigt werden, dass trotz normaler Anzahl von Podosomen und detektierten Mikrotubuli-Plus-Enden die Anzahl der Kontakte bei einer Drebrin-Depletion massiv abnimmt, was nahelegte, dass Drebrin an der Initiierung der Kontakte beteiligt ist. Eine signifikante Zunahme der Kontaktanzahl konnte wiederum für INF2-depletierte Zellen gezeigt werden, was bedeutet, dass vorhandenes INF2 als negativer Regulator für Kontakte fungiert. Auch die Kontaktdauer zwischen Mikrotubuli-Plus-Enden und Podosomen wurde untersucht. Hier konnte für INF2-depletierte Zellen eine signifikante Verlängerung und für LSP1-depletierte Zellen eine Verringerung der Kontaktdauer festgestellt werden, was einen Hinweis darauf gibt, dass einerseits die Initiierung des Kontaktes und die Aufrechterhaltung der Podosomen-Mikrotubuli-Verbindung zwei verschiedene Prozesse sind. Anderseits zeigt es, dass Kappenproteine trotz ihrer gleichen Lokalisation im Podosom unterschiedliche Funktionen besitzen können. Weiterhin wurde der Einfluss des Kontaktverhaltens und der Podosomenkomposition auf die Funktion des Podosomes untersucht. Sowohl für die INF2- als auch KANK1-Depletion konnte eine hoch signifikante Verringerung der Podosomen-Lebensspanne beobachtet werden. Dies zeigt, dass sowohl INF2 als auch KANK1 für die Stabilität von Podosomen von Bedeutung sind. Um mehr Informationen über die Struktur der Podosomen unter Depletion der Kandidaten zu erfahren, wurden mit einem bereits veröffentlichten Makro „Poji“ die Profile des typischen Ringproteins Vinculin sowie des Kappenproteins α-Actinin in Relation zu dem Aktinkern vermessen. Dabei wurde für INF2-depletierte Zellen eine Abnahme der Kappenintensität von α–Actinin gemessen, für INF2- und KANK1-depletierte Zellen insbesondere eine Abnahme der Intensität des Ringproteins Vinculin. Möglicherweise liegt hierin auch eine Erklärung für die verminderte Lebenspanne der Podosomen, wenn bei INF2- bzw. KANK1-Depletion die Integrität des Podosomenrings nicht mehr vollständig gewahrt wird. Da, wie bereits erwähnt, die Degradation von extrazellulärer Matrix eine wichtige Funktion der Podosomen darstellt, wurde diese mit Gelatine-Abbau-Versuchen getestet. Bei der Untersuchung der Degradationsfähigkeit konnte gezeigt werden, dass der Verlust von EB3 und/oder Drebrin zu einer Verstärkung des Matrixabbaus führt, der Verlust von INF2 oder KANK1 jedoch eine Unfähigkeit von Matrixabbau zur Folge hat. Da im letzteren Fall möglicherweise wiederum die Integrität des Ringes eine Rolle spielt, wurde insbesondere für den verstärkten Abbaueffekt bei EB3 und/oder Drebrin-Depletion eine Erklärung gesucht. Da das lytische Enzym MT1-MMP für die Degradationsfähigkeit von Bedeutung ist, wurde die Menge an MT1-MMP auf der Zelloberfläche gemessen. Diese Analyse zeigte, dass Zellen mit einer EB3 und/oder Drebrin-Depletion signifikant mehr MT1-MMP an der Zelloberfläche aufweisen. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem vermehrten Abbau, der in diesen Konditionen beobachtet wurde. Zusammengenommen konnte innerhalb dieser Arbeit ein neues Werkzeug entwickelt werden, welches eine deutlich verbesserte und detailliertere Analyse von Mikrotubuli-Podosomen-Kontakten ermöglicht. Neben der Charakterisierung von Drebrin als neuem Kappenprotein, konnte so insbesondere der Einfluss von den Kappenproteinen Drebrin, LSP1 und INF2 für diese Kontakte identifiziert werden. Außerdem wurde eine verkürzte Podosomen-Lebensspanne für INF2- und KANK1-Depletionen verzeichnet, welche mit verringerter Degradation von extrazellulärer Matrix einherging. Eine Steigerung dieser wurde wiederum für Zellen mit Drebrin und/oder EB3 Depletion beobachtet, welche mit erhöhter MT1-MMP Konzentration auf der Zelloberfläche korrelierte.

The focus of this work was the stepwise development of the software-based program "ContactAnalyzer" and its successful application to study and quantify intracellular contacts between podosomes and microtubule plus ends. Podosomes are actin-rich, functionally diverse adhesion structures of many cell systems, and they are formed spontaneously in large numbers in the primary human macrophages studied here. They have a tripartite structure with an actin core, an adhesive ring of plaque proteins such as vinculin, and a cap characterized by proteins such as α-actinin. In addition to adhesion to carry out their other functions, for example, degradation of extracellular matrix, podosomes require lytic enzymes such as the membrane-bound matrix metalloprotease MT1-MMP. The transport of these enzymes in vesicles is accomplished via microtubules, another cytoskeletal component. It has been observed that the contact between microtubule plus ends and podosomes affects the dynamics of podosomes. However, no detailed analysis of these contacts has been made to date; specifically, the influence of different podosome components on these interactions has not been analyzed yet. Initially, eight different proteins were selected as potential candidates that might play a role in the contacts or their regulation. These include inverted formin 2 (INF2), lymphocyte-specific protein 1 (LSP1), supervillin (SV) as known cap proteins, and drebrin (DBN), which was identified as a cap protein in this work. The podosome cap could be a promising microtubule target due to its exposed position. Additionally, a protein of the ring, p21-activated kinase 4 (PAK4), as well as a podosome-associated protein IQ motif containing GTPase-activating protein 1 (IQGAP1), were included in the analysis. Both proteins have been shown to interact with actin and microtubules, respectively, so it should be investigated whether they also affect podosome-microtubule contacts. The two final candidates, KN motif and ankyrin repeat domain-containing protein 1 (KANK1) and protein rich in the amino acids E, L, K and S (ELKS), are part of a complex that stabilizes microtubules close to the cortex, the so-called cortical microtubule stabilization complex (CMSC), and are therefore also potentially involved in the regulation of podosome-microtubule contacts. First, a software-based analysis program named "ContactAnalyzer" was developed and validated to analyze live cell recordings. It uses the coordinates of podosomes and microtubules to determine whether contact occurs and how long it lasts. In addition, other parameters, such as podosome and microtubule number, as well as podosome lifespan, can be evaluated. In preparation of this work, three microtubule plus end (+TIP) markers were investigated, of which EB3 (end binding protein 3) showed the slightest influence on the number of podosomes and microtubule plus ends and the number of contacts between them. Therefore, this marker was chosen for all subsequent analyses to better assess the influence of podosome components. After having selected the podosome components to be studied, the efficiency and influence of their siRNA-based depletion on the general cell and podosome characteristics were investigated. For most depletions of the candidate proteins, no significant change in cell size, podosome number, diameter, or density was observed. INF2-depleted cells exhibited a slightly smaller podosome size and number, leaving podosome density unchanged. KANK1-depleted cells showed a decreased podosome density with a slightly increased podosome diameter. Following these preliminary analyses, the effect of the depletion of individual candidate proteins on contact behavior and contact characteristics was examined. Compared to the control condition, it was shown that despite regular numbers of podosomes and detected microtubule plus ends, the number of contacts massively decreases upon drebrin depletion; this suggests that drebrin is involved in the initiation of contacts. However, a significant increase in contact number was shown for INF2-depleted cells, implying that expressed INF2 acts as a negative regulator of contacts. The contact duration between microtubule plus ends and podosomes was investigated as well: Here, a significant increase in contact duration was found for INF2-depleted cells and a decrease for LSP1-depleted cells, indicating that, on the one hand, initiation of contact and maintenance of the podosome-microtubule junction are two different processes. And on the other hand, cap proteins can have different functions despite their same localization in the podosome structure. Further, this work aimed to determine whether the altered contact behavior and podosome composition impact the podosome function. A massive reduction in podosome lifespan was observed for both INF2 and KANK1 depletion. This indicates that both INF2 and KANK1 are important for podosome stability. To learn more about the structure of podosomes under depletion of the candidates, a previously published macro, "Poji", was used to measure the profiles of the typical ring protein vinculin and the cap protein α-actinin in relation to the actin core. A decrease in the cap intensity of α-actinin was measured for INF2-depleted cells, and a decrease in the intensity of the ring protein vinculin was measured for INF2- and KANK1-depleted cells in particular. This may also explain the podosome's decreased lifespan when the integrity of the podosome ring is no longer fully maintained upon INF2 or KANK1 depletion. Since, as mentioned above, degradation of the extracellular matrix is an essential function of podosomes, it was tested with gelatin degradation experiments. When the degradation capacity was examined, it was shown that the loss of EB3 and/or drebrin leads to an enhancement of matrix degradation, but the loss of INF2 or KANK1 results in an inability of matrix degradation. Whereas in the latter case, the ring's integrity may again play a role, an explanation was sought for the enhanced degradation effect upon EB3 and/or drebrin depletion. Since the lytic enzyme MT1MMP is essential for the degradation capacity, the amount of MT1-MMP on the cell surface was measured. This analysis showed that cells with EB3 and/or drebrin depletion had significantly more MT1-MMP on the cell surface. This result is consistent with the increased degradation observed in these conditions. Collectively, a new tool was developed within this work that allows a significantly improved and more detailed analysis of microtubule-podosome contacts. Besides the characterization of drebrin as a new cap protein, the influence of the cap proteins drebrin, LSP1, and INF2 for these contacts could be identified. In addition, a shortened podosome lifespan was recorded for INF2 and KANK1 deletions, which was associated with reduced extracellular matrix degradation. On the other hand, an increase in this was observed for cells with drebrin and/or EB3 depletion, correlating with an increase in cell surface located MT1-MMP, suggesting a role of these proteins in endocytosis.