Lokalisation und Funktion von Swiprosin-1 an Podosomen humaner Makrophagen

Abstract

Podosomen sind Aktin-reiche Strukturen die insbesondere in Zellen der monozytären Linie, wie Osteoklasten, dendritischen Zellen und Makrophagen vorkommen. Sie erfüllen eine Vielzahl von Funktionen, vor allem im Rahmen der Adhäsion und Migration, sowie der Degradation der extrazellulären Matrix. Bei Podosomen handelt es sich zusätzlich um mechanosensitive Strukturen, die durch eine regelmäßige Protrusion die Topografie und Rigidität des extrazellulären Raums detektieren können. Podosomen bestehen neben dem Aktin-reichen Kern auch aus einem Ring adhäsiver Plaqueproteine sowie einer Kappe aus regulatorischen Proteinen und weisen zwei verschiedene Gruppen von Kabeln aus Mysoin-haltigen, parallelen Aktinbündeln auf. Die dorsalen Kabel verbinden dabei individuelle Podosomen miteinander zu übergeordneten Strukturen, während die lateralen Kabel Zugkräfte auf den mechanosensitiven Ring ausüben können. Swiprosin-1 (SWS1) ist ein Aktin-bindendes und Calcium-sensitives Strukturprotein, das Einfluss auf die Organisation von Aktinfilamente nehmen kann. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirkungsweise von SWS1 auf die Podosomen primärer humaner Makrophagen zu untersuchen. Dabei wurde beobachtet, dass SWS1 trotz seiner endogenen Lokalisation im Podosomenkern keinen nachweisbaren Einfluss auf deren Zahl oder Architektur nimmt, da diese sich weder durch Überexpression, noch durch Depletion ändern. Während SWS1 auch keinen Einfluss auf die Aktinpolymerisationsrate zu nehmen scheint, kontrolliert es offensichtlich die Organisation der Aktinfilamente im Podosomenkern und reguliert damit die Protrusionsstärke in den extrazellulären Bereich. Dabei reduzierte die Depletion von endogenem SWS1 die Fraktion stabilerer Aktinfilamente im Podosomenkern, was eine Reduktion in sowohl lateraler Protrusionsfläche, als auch vertikaler Protrusionstiefe nach sich zog. Bei endogener SWS1-Expression konnte eine Calcium-sensitive Aktivierung des Kabelproteins Myosin IIA beobachtet werden, was zu Veränderungen der Podosomenarchitektur führte. In SWS1-depletierten Zellen lag die Myosin IIA-Aktivierung im Gegensatz dazu deutlich reduziert vor, und auch die assoziierten Effekte auf die Podosomen wurden größtenteils aufgehoben. Zusätzlich zur Analyse podosomaler Effekte des SWS1 wurde eine erste Identifikation potentieller Interaktionspartner durchgeführt. Hierbei wurden neben Proteinen der Quervernetzung und Bündelung von Aktinfilamenten auch Regulatoren des Aktinfilamentwachstums identifiziert, sowie sowohl Ring- als auch Membran-Adhäsionsproteine detektiert. Zusammengenommen scheint SWS1 Einfluss auf die Aktinorganisation des Kerns und damit auf die Kraftauswirkung und -weiterleitung der Podosomen zu nehmen. Zusätzlich konnten aktuelle Podosomenmodelle bestätigt und Hinweise auf eine unterschiedliche Regulation der Aktinbündel des Kerns und der Kabel erhalten werden. Die genaue Wirkungsweise und Regulation von SWS1 auf die Filamentorganisation muss in nachfolgenden Arbeiten weiter untersucht werden. Ein Großteil der präsentierten Ergebnisse wurde mit dem Algorithmus Poji erhalten, der speziell für die Auswertungen im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde. Die Effektivität von Poji liegt dabei vor allem in seiner Fähigkeit, als erster Algorithmus im Kontext der Podosomenforschung eine große Datenmenge automatisch auswerten und dabei zelluläre und podosomale Parameter miteinander verbinden zu können. Die Entwicklung von Poji, die ebenfalls einen Teil dieser Doktorarbeit darstellt, wurde zusammen mit Anwendungsbeispielen publiziert (Herzog et al., 2020) und sein Algorithmus öffentlich zur Verfügung gestellt (www.github.com/roherzog/poji). Poji dient durch die transparente Dokumantation seines Quellcodes zudem als ideale Plattform, um Funktionserweiterungen und Anwendungsoptimierungen in seinen bereits existierenden Algorithmus zu integrieren und damit als Standardmethode der Podosomenforschung weit über den Rahmen dieser Doktorarbeit hinaus Verwendung zu finden.

Podosomes are actin-rich structures that are predominantely formed in cells of the monocytic line, like osteoclasts, dendritic cells and macrophages. They fulfil a variety of functions, especially in the context of adhesion and migration, as well as degradation of the extracellular matrix. Podomes are mechanosensitive structures that are able to detect the topography and rigidity of the extracellular space by means of a periodic protrusion. Podosomes contain an actin-rich core structure, as well as a ring of adhesive plaque proteins, a cap of regulatory proteins and two sets of cables, which are myosin-rich, parallel actin bundles. The dorsal cables connect individual podosomes into superstructures, while the lateral cables exert traction forces onto the mechanosensitive ring. Swiprosin-1 (SWS1) is an actin-binding and calcium-sensitive structure protein that has an influence on the organization of actin filaments. The aim of the presented thesis was to investigate the impact of SWS1 on the podosomes of primary human macrophages. It was observed that SWS1, despite its endogenous localization in the podosome core, did not have an influence on their number or architecture, as these were unchanged upon SWS1-depletion or -overexpression. SWS1 did not seem to influence the polymerisation rate of actin but obviously controlled the organization of actin filaments in the podosome core and thus its protrusion into the extracellular space. The depletion of SWS1 reduced the fraction of stable actin filaments in the podosome core which resulted in a decrease of lateral protrusion area as well as vertical protrusion depth. In cells with endogenous SWS1-expression, a calcium-sensitive activation of the cable protein myosin IIA was observed, which led to changes in the architecture of podosome. In SWS1-depleted cells, the myosin IIA activation was strongly reduced and the associated effects were close to nullified. In addition to the analysis of SWS1-mediated effects on podosomes an initial identification of potential interaction partners was conducted. Here, proteins that regulate actin filament bundling and crosslinking were identified together with regulators of actin filament growth as well as ring- and membrane-adhesion-proteins. Summarized, SWS1 seems to impact the actin organisation of the core and thus the force generation and -transmission of podosomes. Additionally, current podosome models were confirmed and initial hints towards a differentiated regulation of the actin bundles of core and cables were obtained. The specific function and regulation of the filament organisation by SWS1 has to be further elucidated in future research. A majority of the presented results were obtained by means of the algorithm Poji, which was developed specifically for the evaluation of data in context of this thesis. The efficiency of Poji, as the first algorithm in the context of podosome research, lies primarily in its ability to analyse big data sets automatically and to relate the podosmal and cellular parameters it obtained. The development of Poji, which also is a part of the presented thesis, was published together with proofs of principle (Herzog et al., 2020) and the algorithm is publicly available (www.github.com/roherzog/poji). Due to the transparent documentation of the source code, Poji additionally acts as platform for enhancements and improvements of the existing algorithm and may serve as a standard method in podosome research, well beyond the scope of this thesis.