Titel: Integrative Structural Analysis of the Type III Secretion System from Gram-negative Bacteria
Sprache: Englisch
Autor*in: Flacht, Lara
Schlagwörter: type III secretion system; structural analysis; secretin; needle complex isolation; pilotin; Shigella flexneri
GND-Schlagwörter: StrukturbiologieGND
MultiproteinkomplexGND
Gram-negative BakterienGND
VirulenzGND
Erscheinungsdatum: 2022
Tag der mündlichen Prüfung: 2023-01-13
Zusammenfassung: 
The type III secretion system (T3SS) is a giant, megadalton protein complex utilized by many Gram-negative bacteria to initiate infection. It is composed of the membrane-spanning needle complex and further cytosolic components, such as the sorting platform, regulators, effector proteins, and their corresponding chaperones. During infection, effectors are transported from the bacterial cytosol directly into the host cell by the T3SS to govern host cell function in favor of the pathogen. Understanding the structure and underlying molecular mechanisms of the T3SSs is essential for future drug development targeting this system. Still, the most detailed structural knowledge of the T3SS needle complex originates from a single pathogen within the Salmonella genus. To expand the understanding of T3SSs, this work focused on the needle complex from a pathogen of an additional genus, Shigella flexneri.
First, the existing needle complex isolation procedure was adapted for downstream analysis. This included the exchange of buffering agent (to HEPES) and detergent (to Triton X-100 or lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG)). Cell harvest at lower optical density (measured at a wavelength of 600 nm (OD600nm)) improved overall sample quality as far as could be determined by negative stain electron microscopy. Further, the choice of culture medium, either lysogeny broth (LB) or tryptic soy broth (TSB), did not affect sample quality. However, the choice of culture media did impact growth behavior. The utilized Shigella strain grew faster in TSB than in LB (as measured by OD600nm), and plasmid induction negatively impacted the growth rate in all samples. In addition, a fast, non-denaturing dot blot procedure is described, which can detect the needle complex subunits MxiG [SctD] and the strep-tagged-MxiH [SctF] that will aid in monitoring future isolation procedures.
Analysis of the isolated needle complex's atomic model of the secretin (MxiD [SctC]) obtained by single particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) demonstrated that it adopts a large, pentadecameric, doubly-walled β-barrel highly similar to its Salmonella homolog. The secretin C-terminal S domain, however, adopts a unique, laterally extended fold. To investigate regions that could not be structurally resolved by cryo-EM, a cross-linking procedure for the isolated needle complex and Shigella cells in vivo was established and subsequently analyzed with mass spectrometry (MS). Cross-links obtained from the isolated needle complex confirmed the models obtained by cryo-EM and disclosed the presence of an additional subunit: the pilotin (MxiM [SctG]). An interactive modeling approach could state the localization of the pilotin, which, however also revealed high flexibility of this subunit. In contrast, cross-links generated in vivo suggested a more defined localization of the pilotin. Together with previous work, these findings indicate that the pilotin of Shigella remains bound to the fully assembled T3SS needle complex, likely enabled by the unique fold of the secretin's S domain.
Native MS analysis of the recombinantly expressed Salmonella sorting platform ATPase InvCΔ79 [SctN] demonstrated that the construct can adopt monomeric and dimeric states. Additionally, a dense network of cross-links was generated from the soluble sorting platform sub-complex SpaO/SpaOC/OrgB/InvC [SctQ/SctQC/SctL/SctN] that could be utilized in a future integrative modeling approach.
This work contributes to a better understating of the T3SS, which, if further advances in the future, could be used (e.g., in drug development) to treat infections caused by T3SS-dependent Gram-negative bacteria.

Das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) ist ein Megadalton Proteinkomplex der von vielen Gram-negativen Bakterien während der Infektion genutzt wird. Es besteht aus dem membrandurchspannenden Nadelkomplex und weiteren zytosolischen Komponenten, wie die Sortierungsplattform, Regulatoren und die zu transportierenden Effektorproteine sowie deren zugehörigen Chaperonen. Während der Infektion werden Effektorproteine mithilfe des T3SS direkt aus dem bakteriellen Zytosol in die Wirtszelle transportiert, um die Funktion der Wirtszelle zu Gunsten des Erregers zu modulieren. Für die künftige Entwicklung von Medikamenten, welche auf dieses System abzielen, ist es von entscheidender Bedeutung, die Struktur und die zugrundeliegenden molekulare Mechanismen des T3SS zu verstehen. Jedoch stammt das meiste strukturelle Wissen über den T3SS Nadelkomplex bisher von nur einem einzigen Bakterium aus der Gattung der Salmonellen. Daher konzentriert sich diese Arbeit auf die Strukturanalyse des T3SS Nadelkomplexes von einem Bakterium aus einer weiteren Gattung: Shigella flexneri.
Zunächst wurde das bestehende Verfahren zur Isolierung des T3SS Nadelkomplexe für die darauffolgenden Versuche angepasst. Dazu gehört der Austausch des Puffers (zu HEPES) und des Detergens (zu Triton X-100 oder Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG)). Die Gesamtqualität der Nadelkomplexprobe war besser, wenn die Shigellen bei niedrigeren optischen Zelldichten (gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600nm)) geerntet wurden als denen, die bei höheren dichten geerntet wurden. Die Wahl des Kulturmediums, entweder lysogeny broth (LB, engl.) oder tryptic soy broth (TSB, engl.) wiederum, hatte keine Auswirkung auf die Qualität der Probe, soweit dies anhand negativ-kontrastierten transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen beurteilt werden kann. Allerdings wuchsen die Bakterien (gemessen an der OD600nm) im TSB-Medium schneller als im LB- Medium, und das Wachstum wurde durch die Plasmidinduktion negativ beeinflusst. Darüber hinaus wird ein schnelles, nicht-denaturierendes Dot-Blot-Verfahren beschrieben, mit dem die Nadelkomplex-Untereinheiten MxiG [SctD] sowie das Strep-MxiH [SctF] nachgewiesen werden können. Dieses Verfahren wird die Überwachung künftiger Isolierungen vereinfachen.
Die Analyse der Proteinstruktur vom Sekretin (MxiD [SctC]), welche durch Einzelpartikel- Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) des isolierten Nadelkomplexes gewonnen wurde, zeigte, dass der Sekretinkomplex ein großes, pentadekameres, doppelwandiges β-Fass bildet. Obwohl dieser Sekretinkomplex seinem Salmonella-Homolog sehr ähnlich ist, nimmt die C-terminale S-Domäne, eine einzigartige Konformation an. Um Regionen zu untersuchen, welche nicht durch Kryo-EM bestimmt werden konnten, wurde ein Quervernetzungsverfahren (engl. cross-linking) angewandt. Dieses Verfahren musste für den isolierten Nadelkomplex, sowie für Shigella-Zellen in vivo zunächst etabliert und anschließend mithilfe von Massenspektrometrie (MS) analysiert werden. Die resultierenden Quervernetzungen aus dem isolierten Nadelkomplex bestätigten zunächst das Vorhandensein des Pilotins (MxiM [SctG]). Des Weiteren konnte durch eine integrative Modellierungsmethode die Lokalisierung des Pilotins weiter eingegrenzt werden, welche jedoch auch die hohe Flexibilität des Pilotins offenlegte. Im Gegensatz dazu, ließen in vivo erzeugte Querverbindungen auf eine definiertere Lokalisierung mit geringerer Flexibilität des Pilotins schließen. Zusammen mit früheren Erkenntnissen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Pilotin in Shigella an den vollständig assemblierten T3SS-Nadelkomplex gebunden bleibt, was wahrscheinlich durch die einzigartige Faltung der S-Domäne des Sekretins ermöglicht wird.
Native MS-Analysen der rekombinant exprimierten Salmonella-Sortierplattform-A TPase InvCΔ79 [SctN] zeigten, dass das Konstrukt sowohl monomere als auch dimere Zustände annehmen kann. Darüber hinaus wurde ein dichtes Netzwerk von Querverbindungen aus dem löslichen Sortierplattform-Unterkomplex SpaO/SpaOC/OrgB/InvC [SctQ/SctQC/SctL/SctN] generiert, dass in einer zukünftigen integrativen Modellierungsanalyse verwendet werden kann.
Diese Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis des T3SS bei, welches, wenn in Zukunft fortentwickelt, dazu verwendet werden könnte (z.B. bei der Medikamentenherstellung) um Infektionen mit Gram-negativen Bakterien die das T3SS benötigen, zu bekämpfen.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/10055
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-106513
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Kolbe, Michael
Uetrecht, Charlotte
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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