Characterization of a phloem-mobile RNA-binding protein and the circRNA content of the phloem of Brassica napus

Abstract

Due to the sessile lifestyle of plants, they cannot escape abiotic and biotic stresses. Therefore, they must employ effective signaling to encounter obstacles by effective signaling and response. A better understanding of the long-distance transport and signaling system within plants would allow these systems for breading plants more resistant against abiotic and biotic stresses. Therefore, this work investigates the long-distance transport and signaling of RNAs in phloem of plants. Here, the prominent phloem-mobile RNA-binding protein GRP7 and the circular RNA (circRNA) content of the phloem were analyzed. To better understand the involvement of GRP7 in RNA long-distance transport and signaling, the general RNA-binding ability of both, AtGRP7 (Arabidopsis thaliana GRP7) and BnGRP7 (Brassica napus GRP7) was studied, for more information about the target RNAs of GRP7. Following this, the affinities of both GRP7s were tested for different RNA length and modifications to identify possible preferences of the protein. Finally, the involvement of the glycine-rich region (RGG-domain) of GRP7 in RNA-binding was further analyzed. GRP7 showed a very broad range of RNA-binding, suggesting it is a none-specific RNA-binding protein. Additionally, GRP7 bound shorter RNAs with a higher affinity than long RNAs. Some exception occurred, like GRP7s own pre-mRNA, which was bound with an equally high binding affinity. No preference of GRP7 could be detected for methylated or double-stranded RNAs. The glycine-rich region of GRP7 proved to be an important element in the RNA-binding ability of GRP7. Small changes within the glycine-rich region showed significant changes in the RNA-binding affinity of GRP7 and the removal of the RGG-domain resulted in a lower affinity towards short RNAs and no binding at all for long RNAs. Thus, the RGG-domain of GRP7 has an important role in the RNA-binding of this protein. In further experiments like SEC-SAXS, the high flexibility of the glycine-rich region and the ability of GRP7 to form condensates was demonstrated. In addition to GRP7, the content of circular RNAs in the phloem sap of B. napus was studied. Circular RNAs are derived from back-splicing of pre-mRNAs, resulting in the covalent link of the 3’ and 5’ end and thus stable, circRNAs. To investigate the circRNA content of B. napus phloem, sequencing of a long non-coding library and a circRNA enriched library of leaf and phloem sap was analyzed. In phloem sap, 93 and 15 circRNAs were identified from the two sequencing libraries respectively. Nine of these RNAs were found in both sequencing libraries. To further prove the predicted circRNAs, RT-PCR was done for circRNAs with divergent (for circular RNAs) and convergent (for linear RNAs) primer pairs, resulting in amplicons for five of seven tested circular RNAs. The Sanger sequencing of the back-splicing junction (BSJ) for four of these RNAs proved their circularity. Further experiments to demonstrate the circularity of RNAs in the phloem as well as to investigate their roles and functions within the long-distance transport and signaling system of plants.

Aufgrund ihres sessilen Lebensstils sind Pflanzen nicht in der Lage vor abiotischen und biotischen Stressfaktoren zu fliehen. Dadurch müssen Pflanzen sich mithilfe einer effektiven Kommunikation und Reaktion diesen Problemen stellen. Ein besseres Verständnis des Langstreckentransport und der Langstreckenkommunikation kann für die Züchtung von Pflanzen genutzt werden, welche resistenter gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren sind. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit der Langstreckentransport und die Langstreckenkommunikation von Pflanzen untersucht. Dies wurde durch die Charakterisierung des bekannten, Phloem-mobilen Proteins GRP7 und die Identifizierung von zirkulären RNAs im Phloem erreicht. Um ein besseres Verständnis für den Einfluss von GRP7 auf den Langstreckentransport von RNAs zu erhalten wurde untersucht welche RNAs das Arabidopsis thaliana und Brassica napus GRP7 binden kann. Zudem wurde getestet wie stark die Bindungsaffinität von GRP7 für RNAs verschiedener Länger und mit verschiedenen Modifikationen ist. Auch der Einfluss der Glycin-reichen Region von GRP7 auf die Bindungsaffinität von RNA wurde untersucht. Dies führte zu dem Ergebnis, dass GRP7 kürzere RNAs mit einer höheren Affinität bindet als längere RNAs. Jedoch gibt es auch einige Ausnahmen an längeren RNAs, wie zum Beispiel die prä-mRNA von GRP7, welche ebenfalls mit einer hohen Affinität gebunden werden. GRP7 zeigte jedoch keine Präferenz gegenüber doppelsträngigen oder methylierten RNAs. Selbst kleine Änderungen in der Glycin-reiche Region von GRP7 zeigten eine veränderte Bindeaffinität von GRP7 insbesondere gegenüber langer RNAs. Die Entfernung des kompletten Glycin-reichen Bereichs von GRP7 führte dazu, dass kurze RNAs nur noch schwach und lange RNAs gar nicht mehr gebunden werden konnten. Daraus lässt sich schließen, dass die Glycin-reiche Region von GRP7 eine wichtige Funktion in der RNA-Bindung des Proteins innehat. In weiteren Experimenten wurde eine hohe Struktur-Flexibilität der Gylcin-reichen Region und die Fähigkeit von GRP7 Kondensate zu bilden nachgewiesen. Zudem wurde der Phloemsaft von B. napus auf seinen Gehalt an zirkulären RNAs untersucht. Zirkuläre RNAs entstehen durch das back-splicing von linearen Transkripten, welches in einer kovalenten Bindung zwischen 3‘ und 5‘-Ende der RNA und damit in einer besonders stabilen RNA resultiert. Um den Gehalt an zirkulären RNAs im Phloemsaft zu untersuchen, wurden lnc-RNA Sequenzierdaten und circRNA-Sequenzierdaten von Blatt- und Phloemproben von B. napus verwendet. Es wurden 93 (lncRNA Sequenzierung) bzw. 15 zirkuläre RNAs (circRNA Sequenzierung) im Phloem identifiziert. Neun der circRNAs wurden in beiden Sequenzierungen gefunden. Zur weiteren Überprüfung identifizierter circRNAs wurde eine RT-PCR mit konvergenten (für lineare RNAs) und divergenten (für circRNAs) Primern durchgeführt, welche in Amplifikaten für fünf der sieben getesteten divergenten Primerpaare resultierte. Eine Sanger-Sequenzierung der back-splicing junction konnte für vier RNAs ihre Zirkularität bestätigen. Weitere Versuche zur Überprüfung der Zirkularität sowie der Funktion von zirkulären RNAs müssen durchgeführt werden, um die Funktion der circRNAs im Langstrecken-Transport und Kommunikations-System der Pflanzen zu verstehen.