Structural studies on novel antimicrobial peptides and target protection mechanisms in bacterial pathogens

Abstract

Die steigende Zahl multi-resistenter pathogener Bakterien macht verfügbare Antibiotika auf lange Zeit gesehen wirkungslos und erfordert eine umgehende Erforschung neuer antimikrobieller Substanzen. Eine Vielzahl der aktuell klinisch verwendeten Antibiotika hat das Ribosom als Ziel, spezifisch die Translation. In allen lebenden Zellen synthetisiert das Ribosom während der Translation die Proteine basierend auf einer mRNA-Vorlage. Jede Stufe der Translation wird von mindestens einer Antibiotika-Klasse als Ziel genutzt und basierend auf einer großen Vielfalt chemischer Verbindungen und Wirkmechanismen bietet sich ein großes Potential für zukünftiges strukturbasiertes Wirkstoffdesign. Eine der Methoden der Wahl für das strukturbasierte Wirkstoffdesign von antimikrobiellen Verbindungen, die das Ribosom als Ziel haben, ist die Kryo-Elektronenmikroskopie. Die großen Ribosomen-Komplexe können im schockgefrorenen Zustand, durch Vitrifizierung in einer amorphen Eisschicht eingehüllt, in einem nahezu physiologischen Zustand analysiert und durch „Single Particle Analysis“ in fast atomarer Auflösung 3-dimensional rekonstruiert werden. In dieser Arbeit wurden zwei natürlich vorkommende antimikrobielle Peptide im Komplex mit den Escherichia coli 70S Ribosomen aufgeklärt, genauer die Myxovalargin-Derivate MyxA/B aus Myxococcus fulvus und die Prolin-reichen und O-glykosylierten Drosocin-Derivate aus Drosophila melanogaster. Während beide Peptide im ribosomalen Tunnel binden, verwenden sie sehr unterschiedliche Mechanismen, die verschiedene Stufen der Translation behindern. MyxA/B füllen den Tunnel in einer sehr kompakten Konformation aus und werden dabei durch direkte und Wasser-vermittelte Interaktionen mit 23S ribosomalen RNA-Nukleotiden stabilisiert. In Anwesenheit von MyxA/B kann die Initiator fMet-tRNAfMet in der P-Stelle des Ribosoms binden, wird jedoch durch die C-terminalen hydrophoben Reste von MyxA/B an der korrekten Akkommodation des CCA-Endes gehindert. Aminoacyl-tRNAs, die in der A-Stelle des Ribosoms binden, würden nahe dem Peptidyltransferase-Zentrum sterisch mit MyxA/B überlappen. Dies führt zur Inhibierung der letzten Stufe der Initiation. Während Drosocine ebenfalls im Tunnel binden und direkte sowie Wasser-vermittelte Interaktionen bilden, weisen diese natürliche O-Glykosylierungen an ihrem Thr11 auf, welche das A752-U2609 Basenpaar der 23S rRNA-Nukleotide spalten und hierdurch die Bindung im Tunnel weiter verstärken. Drosocine verhindern die Dissoziation der „Release“ Faktoren von den Ribosomen in einem Post-Hydrolyse Status und inhibieren die Terminierung und das anschließende Recycling des Ribosoms. Neben Antibiotika, die das Ribosom als Ziel haben, um mittels bakterizider Effekte die Bakterien zu töten oder mittels bakteriostatischen das Wachstum zu stören, ist auch die Untersuchung der Antibiotika, die zur Krebsbekämpfung auf die Translation von spezifischen Proteinen in eukaryotischen Zellen abzielen. In der eukaryotischen Translation ist Kontextspezifität von Antibiotika essenziell, um die Behinderung von genereller Proteinsynthese zu vermeiden. In dieser Arbeit wurde das für seine kontextspezifische Inhibierung der Peptidbildungs-Bildung in Bakterien bekannte Makrolid-Antibiotikum Telithromycin, an mutierten Saccharomyces cerevisiae Ribosomen getestet. Eine identische Bindungsstelle für das Antibiotikum in den eukaryotischen Ribosomen wurde identifiziert. Forschungspartner bestätigten eine kontextspezifische Inhibierung der eukaryotischen Translation, welches eine neue Basis für diese Klasse von Antibiotika in Eukaryoten schafft. Für die Zukunft der Antibiotika-Landschaft ist neben dem strukturbasiertem Wirkstoffdesign von Verbindungen, die sowohl bakterielle als auch eukaryotische Translation als Ziel haben, die Aufklärung der Mechanismen wichtig, die Antibiotikaresistenz in Bakterien verursachen. In dieser Arbeit wurde die Struktur eines neuartigen Resistenz-Homologes des „Housekeeping Splitting“ Faktors GTPase HflX aus Listeria monocytogenes, HflXr, aufgeklärt. Diese zeigt, dass das Arg149 aus der „loop“-Region der N-terminalen Domäne II von HflXr deutlich tiefer in das Peptidyltransferase-Zentrum eindringt, als nicht Resistenz-bringendes HflX, dessen „loop“ zwei Aminosäuren kürzer ist. Der HflXr „loop“ induziert Konformationsänderungen in den 23S rRNA-Nukleotiden, welche die Bindung von Antibiotika nahe dem Peptidyltransferase-Zentrum unmöglich machen, wodurch im geringem Maße Resistenz gegen diese Antibiotika erzeugt wird. Die hier beschriebenen Arbeiten zur strukturellen Aufklärung verschiedener antimikrobieller Verbindungen, sowie biochemischer und molekularbiologischer Methoden an Ribosomen-spezifischen Antibiotika, vermitteln ein tieferes Verständnis in Mechanismen der Antibiotikaresistenz und bekräftigen die Wichtigkeit von strukturellem Wirkstoffdesign im Kampf gegen multiresistente Pathogene und Krankheiten.

The rise in multidrug resistance in bacterial human pathogens may soon render our current repertoire of antibiotics obsolete and it requires immediate action to research new antimicrobial substances. Most clinically used antibiotics target the ribosome and more specifically interfere with translation. In all living cells, during translation the ribosome synthesizes proteins based on a mRNA template. Each step of this process is targeted by at least one class of known antibiotics and provides a huge variety of chemical scaffolds and mechanisms of action that have potential for future structure-based drug design. One of the methods of choice for structure-based drug design of antimicrobials targeting the ribosome is cryo-electron microscopy. Ribosomal complexes can be analyzed in a flash-frozen, near-physiological state through vitrification in a layer of amorphous ice and single particle analysis achieves near atomic resolution of 3D reconstructions. In this study two naturally occurring antimicrobial peptides were structurally investigated in complex with the Escherichia coli 70S ribosome, namely the myxovalargins MyxA/B from Myxococcus fulvus and the proline-rich and O-glycosylated drosocins from Drosophila melanogaster. While both peptides bind within the nascent peptide exit tunnel of the ribosome, they have very different mechanisms of inhibition and interfere with different stages of translation. MyxA/B occludes the tunnel in a very compacted conformation and is stabilized by both direct and water-mediated interactions with the 23S ribosomal RNA nucleotides of the tunnel. In the presence of MyxA/B, the binding of an initiator fMet-tRNAfMet in the P-site of the ribosome is possible but the C-terminal hydrophobic moieties of MyxA/B interfere with proper accommodation of the CCA-end. Incoming amino acyl-tRNAs in the A-site would sterically clash close to the peptidyl transferase centers with MyxA/B and as a result translation is inhibited at a late stage of initiation. While drosocins also bind in the nascent peptide exit tunnel and form both direct and water-mediated interactions with the ribosome, they are naturally O-glycosylated on Thr11 which splits the base-pair of A752-U2609 of the 23S rRNA stabilizing their binding in the tunnel. They lock the release factors on the ribosome in a post-hydrolysis state and interfere with translation termination and subsequent recycling. While antibiotics targeting bacterial translation are meant to kill the bacteria with a bactericidal effect or stop their growth with a bacteriostatic effect, the use of antibiotics targeting the synthesis of specific proteins in eukaryotic cells to fight cancer are similarly important. In eukaryotic translation the context-specificity of antibiotics is essential to avoid interfering with general protein synthesis. In this study a macrolide antibiotic, telithromycin, which is known to cause context-specific inhibition of peptide bond formation in bacteria, was tested on mutant Saccharomyces cerevisiae ribosomes, which revealed an identical binding site for the drug in the eukaryotic ribosome. Additionally, collaborators confirmed context-specificity in eukaryotic translation, opening a new scaffold for this class of antibiotics on eukaryotes. While structure-based drug design of compounds targeting both bacterial and eukaryotic translation is essential for the future of the antibiotic landscape, the mechanisms conferring resistance in bacteria similarly deserve attention. In this study a structure of a novel resistance homolog of the housekeeping splitting factor GTPase HflX in Listeria monocytogenes, HflXr, is presented. The structure revealed that Arg149 of the loop region of the N-terminal domain II of HflXr penetrates deeper into the peptidyl transferase center than the non-resistance providing homolog HflX, which has a loop that is two amino acids shorter. The loop of HflXr induces a conformational change in the 23S rRNA nucleotides of the PTC which is incompatible with antibiotic binding near the PTC, thereby providing a low level of resistance to these antibiotics. The structural investigation of different antimicrobial compounds presented in this study, combined with other biochemical and molecular biology approaches, on antibiotics targeting bacteria and eukaryotes, as well as a deeper understanding of resistance mechanisms, could provide insight into the importance of structure-based drug design efforts in the fight against multi-drug resistant pathogens and human diseases.